La BR dénaturée et native peut se lier à GroEL
Le mécanisme central de l’activité de GroEL est sa capacité à reconnaître une gamme diverse de polypeptides principalement par des interactions entre les résidus hydrophobes du substrat et les hélices H et I sur les domaines apicaux de GroEL (Fig. 1A) (Coyle et al. 1997). Ici, la liaison du BR dénaturé et natif à GroEL a d’abord été examinée par calorimétrie de titrage isotherme (ITC), puisque chaque état possède des résidus de surface hydrophobes abondants qui sont facilement accessibles à GroEL. Comme le montre la figure 2A, le titrage de GroEL avec BR donne des thermogrammes de titrage exothermiques dans les deux cas. Les changements de chaleur sont dus spécifiquement à la liaison du BR à GroEL, car l’injection consécutive de BR dans les tampons d’essai sans chaperonine produit des thermogrammes plats (figure supplémentaire S1). La chaleur de chaque injection montrée dans la Fig. 2A a été intégrée, corrigée par la chaleur de dilution, et a été tracée en fonction du rapport molaire de BR : GroEL (Fig. 2B). La variation de chaleur s’ajuste à un ensemble de modèles de liaison des sites (courbes rouge et bleue), donnant une constante de dissociation (Kd) proche de 0,3 nmol/L pour le BR dénaturé et proche de 6,0 nmol/L pour le BR natif, respectivement (tableau 1). Ainsi, la dénaturation du RE augmente l’affinité de liaison de GroEL pour cette protéine membranaire d’un ordre de grandeur. D’autre part, la liaison de l’un ou l’autre des échantillons de BR est entraînée par un changement d’enthalpie favorable (ΔH) et opposée par un changement d’entropie négatif (ΔS) ; la stœchiométrie de liaison (N) déterminée dans les deux cas est proche de l’unité (tableau 1). Cependant, la liaison du BR natif est clairement moins enthalpique avec une moindre compensation entropique.
La liaison du BR à GroEL évaluée par ITC. A Titrage de GroEL avec du BR dénaturé par SDS (dBR, rouge) ou du BR natif (nBR. bleu). Les thermogrammes ont été enregistrés à 20 °C avec un instrument MicroCal ITC200. B L’échange thermique de chaque injection en A a été intégré et représenté en fonction du rapport molaire BR:GroEL. Les lignes solides représentent l’ajustement des données à un modèle d’ensemble unique de sites (tous les sites sont identiques et équivalents) et les paramètres thermodynamiques obtenus sont répertoriés dans le tableau 1
La co-chaperonine GroES en forme de couvercle est un composant essentiel du repliement des protéines médié par GroEL chez les bactéries, et il a été démontré qu’elle partage les mêmes sites de liaison sur GroEL avec le substrat (Chen et Sigler 1999). Le titrage de GroEL avec du BR dénaturé en présence de GroES indique que GroES a peu d’effet sur la liaison du BR (figure supplémentaire S2 et tableau 1). Ce résultat peut être compris en prenant en compte le Kd, qui pour la formation d’un complexe GroEL/ES a été précédemment déterminé comme étant de 3 μmol/L et est significativement plus élevé que celui du complexe BR-GroEL déterminé ici (Behlke et al. 1997). Cela indique une interaction beaucoup plus faible des deux protéines chaperonines et donc cohérent avec l’effet non significatif. Cependant, en présence d’ATP, qui régule les cycles de liaison et de libération de GroEL et GroES in vivo, l’affinité de GroEL/ES augmenterait de trois ordres de grandeur (normalement Kd ~1 nmol/L) (Farr et al. 2000), théoriquement capable de concurrencer la liaison de BR à GroEL. L’effet de l’apoGroEL sur le repliement du BR, puis le rôle de GroES et de l’ATP dans ce processus ont ensuite été étudiés.
Le système GroEL-GroES peut moduler le repliement du BR en présence de DDM
On a observé qu’une partie du BR dénaturé par SDS se replie lorsqu’il est dilué avec un excès de détergent solubilisant n-dodécyl-β-D-maltoside (DDM), comme le révèle la mesure de la récupération de l’absorption rétinienne (figure supplémentaire S3) (Booth 1997). Aucune récupération significative n’était détectable dans le tampon d’essai sans détergent ou complété par GroEL seul. Cependant, en présence de DDM, l’ajout de GroEL a montré un effet évident sur le repliement du RE (figure supplémentaire S3). La constante de vitesse pour le repliement médié par GroEL (0,15 μmol/L), évaluée par l’ajustement à la cinétique exponentielle simple, a été estimée comme étant ~doublée par rapport au repliement spontané. GroEL est connu pour retarder typiquement le repliement des protéines solubles qui peuvent se replier efficacement en son absence. Ceci a été expliqué par une compétition entre le repliement intramoléculaire et la liaison intermoléculaire à GroEL (Gray et Fersht 1993 ; Itzhaki et al. 1995). Il semble tout à fait plausible que GroEL se comporte de manière similaire dans le repliement du BR dénaturé. Lorsque la concentration de GroEL a été augmentée à 0,30 μmol/L, la constante de vitesse estimée n’a pas changé de manière évidente, alors que le rendement du repliement a atteint un niveau beaucoup plus élevé que le repliement spontané après 60 min (figure supplémentaire S3). Ces données démontrent que l’apoGroEL peut diminuer la vitesse de repliement de la BR mais améliorer le rendement de la protéine repliée.
Parce que les cellules bactériennes contiennent plusieurs millimolaires d’ATP et que, dans des conditions normales, le rapport molaire relatif de GroES par rapport à GroEL est de 1,9 et, après un choc thermique, de 4,7 (Moparthi et al. 2013) ; GroEL ne restera probablement pas longtemps sans se lier à l’ATP et à GroES. En présence d’ATP (bleu dans la Fig. 3A), la récupération des BR correctement repliés était significativement plus rapide et plus importante par rapport à celle avec apoGroEL seul ou le processus spontané (rouge et noir dans la Fig. 3A). En revanche, la combinaison de GroEL et GroES a montré peu d’effet sur le taux de repliement spontané mais a réduit le rendement dans une certaine mesure (Fig. 3A, cyan). Cela indique une interaction entre GroEL et GroES sans besoin d’ATP, probablement induite par le BR lié à GroEL, qui a eu à son tour un effet négatif sur la récupération de la protéine correctement repliée. Lorsque le système complet de chaperonine a été utilisé (Fig. 3A, vert), une augmentation maximale de la vitesse a été observée mais le rendement de repliement est tombé entre les deux cas précédents.
Time course of BR folding modulated by ATP-dependent GroEL-GroES system. A La récupération du BR replié a été suivie en continu avec une absorbance à 554 nm. Les ajouts suivants ont été effectués : aucun (noir) ; 0,3 μmol/L GroEL (rouge) ; 0,3 μmol/L GroEL et 5 mmol/L ATP (bleu) ; 0,3 μmol/L GroEL et 0,6 μmol/L GroES (cyan) ; 0,3 μmol/L GroEL, 0,6 μmol/L GroES et 5 mmol/L ATP (vert). B Le repliement net des BR médié par GroEL a d’abord été effectué ; puis à T = 60 min, l’échantillon a été complété avec seulement de l’ATP, avec seulement GroES, ou avec les deux, comme indiqué. C Pour comparaison avec A, l’effet de la version monocyclique (SR1) de GroEL sur le repliement des BR a également été analysé. Les concentrations de SR1, GroES et ATP utilisées étaient de 0,6 μmol/L, 1,2 μmol/L et 5 mmol/L, respectivement. D Les effets de GroEL/ES plus ATP sur le repli natif du BR ont été examinés en suivant le changement d’absorbance à 560 nm. Les concentrations de chaperonine et de nucléotide utilisées en B et D étaient les mêmes qu’en A. Le BR a été maintenu à 2,4 μmol/L dans toutes les expériences. Les lignes bleues et vertes en A et la ligne bleue en C représentent l’ajustement des données à l’équation exponentielle triphasée, tandis que les autres lignes sont l’ajustement à l’équation exponentielle simple. Toutes les lignes en B et D sont de simples guides pour les yeux
Les résultats ci-dessus indiquent que l’ATP et GroES peuvent influencer le repliement du BR médié par GroEL d’une manière différente. La liaison de GroES à GroEL est quelque peu préjudiciable au repliement, contrairement au rôle positif bien connu de l’encapsulation du substrat dans la cage GroEL/ES pour le repliement assisté (Jewett et Shea 2010). Nous nous sommes ensuite demandé comment cet effet négatif était produit. De manière intrigante, GroES seul ou sa séquence de boucle mobile par laquelle GroES se lie à GroEL a également facilité la récupération de BR plié (supplément Fig. S4). De plus, la séquence en boucle a montré un effet similaire à celui de GroES dans le repliement médié par GroEL en l’absence et en présence d’ATP (figure supplémentaire S4). Bien qu’elle ne puisse pas former un capuchon scellé au-dessus de la cavité centrale de GroEL comme GroES, ce qui implique une contribution significative de l’interaction boucle-GroEL au repliement. Notamment, les résidus hydrophobes de la surface apicale de GroEL impliqués dans la liaison de la boucle mobile de GroES se chevauchent pour la plupart avec ceux impliqués dans la liaison de la protéine substrat (Motojima et al. 2000). Il est peu probable que le BR hydrophobe ait été déplacé et libéré dans la cage hydrophile GroEL/ES par la boucle mobile, notamment en raison de la présence de micelles DDM à l’extérieur de la cage, ce qui favoriserait davantage le repliement ou la solubilisation du BR. De préférence, comme cela a été démontré pour le repliement assisté de plusieurs protéines solubles (Motojima et Yoshida 2010), le BR peut être capturé près de l’interface GroEL/ES, dépassant partiellement à l’extérieur lorsque le système entier ou même GroEL/ES seul a été utilisé dans cette étude. Une telle interaction peut empêcher le BR d’accéder aux micelles DDM favorables, ce qui entraîne le rendement de repliement réduit observé à la fois avec GroES et sa boucle mobile.
Cependant, certaines études suggèrent que le rôle de l’ATP et de GroES est uniquement de dissocier les substrats collants (c’est-à-dire avec un Kd dans la région nmol/L déterminée ici), qui limitent le taux de repliement assisté ou même inhibent l’activité de repliement de GroEL s’ils ne sont pas éliminés (Priya et al. 2013). Pour vérifier si GroES et ATP présentent un effet similaire dans le repliement assisté du BR, nous avons d’abord incubé apoGroEL avec du BR dénaturé pendant 60 min ; puis, nous avons ajouté GroEL ou/et ATP (Fig. 3B). L’ajout ultérieur de l’un ou l’autre composant a favorisé le repliement du BR, mais a été moins efficace que l’ajout simultané des deux, ce qui démontre la synergie entre les deux pour aider le repliement médié par GroEL. Les mesures d’anisotropie avec des peptides transmembranaires de BR, qui ont été utilisés comme mimétiques du BR dénaturé pour contourner les complications introduites par la nature dynamique du BR dénaturé et des interactions GroEL-BR, ont montré que seule la combinaison d’ATP et de GroES était capable de séparer efficacement le complexe peptide-GroEL préformé (figure supplémentaire S5). Ainsi, il semble que GroES et l’ATP soient tous deux nécessaires pour dissocier les conformères de BR à haute affinité et régénérer les sites de liaison (ou catalytiques) de GroEL bloqués.
Pour examiner plus avant l’effet de GroES et de l’ATP sur le repliement de BR médié par GroEL, nous avons utilisé un mutant de GroEL à un seul anneau (SR1) qui forme un complexe stable avec GroES (Weissman et al. 1995), contrairement au système cyclique GroEL-GroES. Comme nous l’avons observé avec GroEL, l’ATP a augmenté la vitesse et le rendement du repliement médié par SR1 (bleu sur la figure 3C), tandis que la présence de GroES a considérablement réduit ces deux aspects (cyan) par rapport au cas de l’apoSR1 seul ou au processus spontané (rouge ou noir). Comme il a été déterminé par ITC que le BR dénaturé se lie à SR1 avec une stoechiométrie proche de l’unité (figure supplémentaire S2), et que la concentration de SR1 utilisée était deux fois supérieure à celle de GroEL, nous supposons que davantage de complexes BR-SR1 se sont formés que BR-GroEL, GroES exerçant alors une plus grande influence sur le repliement (cyan). Comme prévu, l’ajout d’ATP et de GroES a montré un effet insignifiant sur le repliement du BR (vert), attribuable à la liaison irréversible de GroES à SR1 en présence d’ATP (Weissman et al. 1995). De plus, ce résultat indique que l’augmentation maximale de la vitesse observée avec GroEL est due à de multiples cycles de liaison et de libération de GroES régulés par l’ATP.
GroEL seul ou en combinaison avec l’ATP ou/et GroES a montré une influence négligeable sur la structure du BR natif solubilisé avec DDM (Fig. 3D), indiquant une interaction intramoléculaire plus forte au sein de la protéine native que la liaison intermoléculaire à GroEL. Ainsi, la transition médiée par la chaperonine du BR de l’état métastable dénaturé à l’état natif est thermodynamiquement favorable.
Preuve à la fois de la désagrégation et du dépliage médiés par la chaperonine
La mesure du repliement spontané du BR à des concentrations variées démontre que l’agrégation n’entraîne qu’une récupération partielle du BR correctement plié et que le taux apparent est indépendant de la concentration, ce qui implique que l’agrégation est irréversible (figure supplémentaire S6). En l’absence de détergent solubilisant DDM, le BR dénaturé par SDS a été estimé par spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) comme ayant un coefficient de diffusion (~67 μm2/s) bien inférieur à celui lié à GroEL (~104 μm2/s) (figure 4). Cela reflète que les agrégats formés par le BR dénaturé sont encore plus grands que le complexe BR-GroEL avec une stœchiométrie de liaison proche de l’unité comme déterminé par ITC. Cela signifie également que GroEL a été capable de perturber la structure d’agrégation, en pompant essentiellement la voie de repliement productive avec le BR monomère. De plus, le nBR solubilisé avec la DDM a été déterminé comme ayant un coefficient de diffusion de ~117 μm2/s, ce qui est plus grand que celui du dBR avec GroEL et beaucoup plus grand que celui du dBR seul (Fig. 4). Cela suggère que le nBR était bien dispersé en présence de DDM et soutient également l’idée d’une désagrégation du dBR médiée par GroEL. En outre, lorsque le système complet de chaperonine a été ajouté au BR dénaturé, des précipités blancs floculants ont été immédiatement visibles (données non présentées), indiquant un dépliage forcé ainsi qu’une synergie entre GroES et ATP dans cet aspect. Sans détergents solubilisants ou lipides qui imitent les membranes biologiques dans la solution en vrac, le BR déplié s’agrégerait instantanément et précipiterait, contrairement à l’augmentation significative de la vitesse de repliement observée en présence de DDM.
Mesure de la FCS du BR dénaturé en l’absence ou en présence de GroEL par rapport au BR natif. Les amplitudes d’autocorrélation de fluorescence G(τ) de la fluorescence Alexa Fluor 488 ont été montrées pour le BR dénaturé par SDS seul ou avec un excès de GroEL en l’absence de détergent solubilisant ou le BR natif solubilisé avec DDM. Les coefficients de diffusion (D) ont été obtenus en ajustant la courbe d’auto-corrélation avec l’équation 1. Les écarts types proviennent de trois mesures indépendantes
Insertion membranaire de BR médiée par GroEL-GroES
Pour déterminer si ou comment GroEL-GroES soutiendrait l’intégration de BR dans la bicouche, des vésicules membranaires cytoplasmiques inversées (IMVs) ont été préparées à partir de cellules Escherichia. coli et mélangées avec du BR dénaturé en présence et en l’absence d’apoGroEL, ou plus ATP/GroES (Fig. 5A). L’apoGroEL a provoqué un changement non significatif dans la récupération du BR correctement replié dans les VIM, comme mesuré par spectroscopie UV-Vis (noir et rouge). Contrairement au repliement dans les micelles DDM, l’ajout de GroEL et d’ATP s’est avéré préjudiciable à l’insertion dans la membrane (bleu), tandis que GroEL combiné à GroES a facilité ce processus (cyan). La raison réelle de cette différence reproductible n’est pas connue, mais la rigidité des IMVs et le changement structurel du BR lié à GroEL induit par la liaison de l’ATP ou de GroES pourraient être des raisons possibles. Plus précisément, la liaison de l’ATP par GroEL est connue pour provoquer une expansion de l’ouverture de la cavité de la chaperonine (Skjaerven et al. 2015). Ce changement est plus important que celui provoqué par la simple liaison de GroES à GroEL (Kim et al. 2005), ce qui peut permettre le dépliage du substrat lié (Lin et al. 2008 ; Sharma et al. 2008), favorable à un repliement productif dans un solvant approprié. Cependant, contrairement aux micelles DDM qui sont très dynamiques, les IMVs étaient probablement incapables de protéger rapidement les espèces de BR dépliées et de fournir en temps voulu un micro-environnement de repliement avantageux. En comparaison, la faible association de GroES avec GroEL en l’absence d’ATP pourrait délivrer le BR aux IMVs préparées d’une manière plus efficace. Cependant, comme pour le repliement dans les micelles DDM, le système complet GroEL-GroES a grandement amélioré l’insertion membranaire du BR (vert), qui a atteint rapidement un état stable, la quantité de BR récupérée se situant entre les deux cas précédents.
Insertion du BR dans les IMVs médiée par le système GroEL-GroES. A L’insertion et/ou le repliement du BR dénaturé (2,4 μmol/L) dans les IMVs ont été surveillés en continu avec une absorbance à 554 nm. Les ajouts suivants ont été effectués : aucun (noir) ; 0,3 μmol/L GroEL (rouge) ; 0,3 μmol/L GroEL et 5 mmol/L ATP (bleu) ; 0,3 μmol/L GroEL et 0,6 μmol/L GroES (cyan) ; 0,3 μmol/L GroEL, 0,6 μmol/L GroES et 5 mmol/L ATP (vert). B Le BR natif peut être transféré efficacement aux IMV en présence de GroEL avec l’aide de l’ATP et de GroES. Les concentrations testées de BR natif, de GroEL, de GroES et d’ATP étaient respectivement de 0,4, 5, 10 μmol/L et 5 mmol/L
Puis, l’anisotropie de fluorescence a été employée pour sonder les effets des chaperonines bactériennes sur l’insertion du BR dans les IMVs (figure 5B). Lorsque du BR natif marqué par fluorescence a été mélangé avec une quantité excessive de GroEL, l’anisotropie s’est déplacée vers une valeur plus élevée, démontrant que la protéine membranaire a formé un complexe stable avec la chaperonine. Il est important de noter que l’ajout ultérieur d’IMVs a conduit à une nouvelle augmentation de l’anisotropie, indiquant l’intégration de BR dans les IMVs. On a constaté que l’ATP et GroES amélioraient encore le transfert de BR dans la membrane, comme en témoigne également l’augmentation de l’anisotropie. Ces résultats soulèvent la perspective que GroEL, ainsi que GroES et ATP, puissent avoir un rôle direct dans l’intégration des protéines dans la bicouche lipidique in vivo.