Introduction
Il existe environ 10 000 espèces de microbes nommées. On estime qu’il y a entre 10 000 et 100 000 autres espèces non identifiées pour chaque espèce identifiée. Non seulement il existe de nombreux types de bactéries, mais il y a aussi beaucoup de bactéries individuelles. Une seule cuillerée de terre peut contenir 100 millions de bactéries individuelles. Un grattage de vos gencives peut donner lieu à un million de bactéries par cm2 (un cm2 est à peu près la taille de votre petit ongle). Les bactéries présentes dans et sur notre corps représentent environ 10% de notre poids corporel sec.
La plupart des espèces de bactéries actuellement connues ont été identifiées à l’aide de techniques microbiologiques traditionnelles telles que la réaction de coloration de Gram, la morphologie et les réactions métaboliques. Les bactéries vivent rarement seules mais en communautés avec d’autres bactéries. Cela est vrai aussi bien dans l’environnement que dans et sur notre corps. Ce cours se concentre sur le rôle des bactéries dans les maladies. L’isolement d’une seule espèce de bactérie est la première étape de l’identification des bactéries possiblement responsables d’un processus pathologique.
La première condition pour isoler physiquement une bactérie est qu’elle puisse être cultivée en laboratoire. Cela nécessite de connaître la température optimale pour la croissance, les besoins optimaux en oxygène et les besoins nutritionnels optimaux. Nous travaillons avec un nombre très limité de bactéries dans ce cours. Les bactéries avec lesquelles nous travaillons sont également très faciles à cultiver en laboratoire. La plupart des bactéries ne sont pas aussi agréables!
Il y a deux façons principales d’isoler les organismes.
- Démontage pour l’isolement sur une plaque de gélose
- La méthode de la plaque à verser
Démontage pour l’isolement sur une plaque de gélose implique la dilution successive des organismes jusqu’à ce que vous ayez les cellules à une densité suffisamment basse pour que les cellules uniques soient physiquement isolées dans l’espace pour donner lieu à des colonies individuelles reconnaissables. Dans la méthode de la plaque de coulée, vous diluez suffisamment votre échantillon avant de l’ajouter à la gélose refroidie et fondue, puis vous versez ce mélange dans un plat. Les cellules isolées donnent naissance à des colonies individuelles qui se développent dans la gélose elle-même. Cette technique peut être un peu délicate. Si la gélose fondue est trop chaude, vous tuez toutes les bactéries. Si la gélose fondue est trop froide, vous vous retrouvez avec un gros morceau dans votre boîte de Pétri. La méthode des stries permet d’obtenir des colonies individuelles à la surface de la gélose. Cette technique est beaucoup plus rapide et plus facile à maîtriser.
Aperçu
On vous donne un échantillon de bouillon contenant trois organismes, Staphylococcus xylosus, Serratia marsescens et Escherichia. coli.
Les trois organismes se développent facilement en aérobiose sur la gélose tryptique de soja (TSA). Cependant, S. marsescens ne forme un pigment rouge qu’à 35°C ou moins et de façon optimale à température ambiante (25°C). Il se développe très rapidement à toutes les températures pour former des colonies de taille moyenne.
E. coli a un aspect bronzé à toutes les températures et se développe également rapidement pour former de grandes colonies.
S. xylosus a un aspect jaune-orange à toutes les températures, se développe rapidement et forme des colonies moyennes à grandes.
Votre capacité à isoler et à voir les trois organismes sur votre plaque dépend des conditions d’incubation appropriées. Vos plaques seront incubées à température ambiante pendant 48 heures. Vous devriez être en mesure d’identifier les trois organismes en fonction de la taille et du pigment des colonies.
Matériels
- 1 culture mixte en tube de bouillon de soja tryptique (TSB) contenant Staphylococcus xylosus, Serratia marsescens et Escherichia. Coli (tous BSL2)
- 3 plaques TSA
Procédure de stries pour l’isolement
Il existe plusieurs méthodes de stries pour l’isolement. La grande majorité de nos étudiants ont eu le plus de succès avec la méthode des quadrants qui est décrite ci-dessous.
- Étiquettez votre plaque avec votre nom, la date, la section et l’organisme.
- Utilisez les procédures BSL2 pour obtenir une boucle pleine d’organismes de votre tube de bouillon tryptique de soja (TSB). Reportez-vous au protocole de technique aseptique.
- Veuillez vous assurer que vous avez mélangé adéquatement votre tube de bouillon afin que les organismes soient uniformément en suspension dans le bouillon.
- Recapturez votre tube de BST.
- Vous pouvez faire la partie suivante avec votre plaque sur la paillasse du laboratoire ou en la tenant dans votre main. Vous décidez de ce qui fonctionne le mieux. Faites glisser légèrement votre boucle d’avant en arrière sur la surface de la gélose. (Reportez-vous à la figure 1.)
- Plus vous traînez, plus vous déposez de bactéries.
- L’idée générale est de diminuer la concentration bactérienne à chaque balayage.
- Quatre à cinq zigzags semblent bien fonctionner.
- Expérimentez avec vos différentes plaques. Assurez-vous de garder une trace de ce que vous avez fait sur chaque plaque.
- Si vous utilisez un incinérateur, stérilisez votre boucle. Si vous utilisez des boucles en plastique, jetez votre boucle usagée dans le récipient de cavicide et obtenez une nouvelle boucle en plastique stérile.
- Ne retournez pas dans le tube de bouillon original.
- Touchez votre boucle à la surface de la gélose contre l’extrémité éloignée de votre première strie. Répétez en tirant d’avant en arrière.
- o Ne tirez pas au centre de votre plaque.
- o Vous devriez être en mesure de voir les faibles indentations de votre ligne de streaking sur la surface de la gélose.
- En utilisant une boucle stérile, répétez la procédure sur votre deuxième streak.
- En utilisant une boucle stérile, répétez la procédure sur votre troisième streak. Zigzaguez la dernière partie au centre de la plaque.
- Vous devriez vous retrouver avec des colonies isolées quelque part dans votre dernière strie.
- Si vous utilisez un incinérateur, stérilisez votre boucle. Si vous utilisez des boucles en plastique, jetez votre boucle usagée dans le contenant de cavicide.
- Remettez le couvercle sur votre plaque.
- Placez vos plaques complétées côté agar vers le haut sur le support d’incubation sur le bureau avant dans la section d’incubation.
Figure 1 : Méthode de stries en quadrant pour l’isolement.
Notes
- Il est absolument essentiel de stériliser votre boucle entre chaque strie, soit en utilisant l’incinérateur, soit en obtenant une nouvelle boucle en plastique stérile. C’est l’erreur la plus courante que font les étudiants.
- Ne laissez pas votre plaque ouverte trop longtemps ou des bactéries supplémentaires de l’environnement tomberont dans votre plaque.
- Ne soyez pas déçu si vous n’obtenez pas de colonies isolées dès votre premier essai. C’est une procédure difficile.