L’échange H-D a été mesuré à l’origine par le père de l’échange hydrogène Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang en utilisant des tubes à gradient de densité. Dans les temps modernes, l’échange H-D a été principalement surveillé par les méthodes : La spectroscopie RMN, la spectrométrie de masse et la cristallographie neutronique. Chacune de ces méthodes a ses avantages et ses inconvénients.
Spectroscopie RMNEdit
Les noyaux d’hydrogène et de deutérium sont grossièrement différents dans leurs propriétés magnétiques. Il est donc possible de les distinguer par spectroscopie RMN. Les deutérons ne seront pas observés dans un spectre RMN 1H et inversement, les protons ne seront pas observés dans un spectre RMN 2H. Lorsque de petits signaux sont observés dans le spectre RMN 1H d’un échantillon fortement deutéré, on parle de signaux résiduels. Ils peuvent être utilisés pour calculer le niveau de deutération d’une molécule. Des signaux analogues ne sont pas observés dans les spectres de RMN 2H en raison de la faible sensibilité de cette technique par rapport à l’analyse 1H. Les deutérons présentent généralement des déplacements chimiques très similaires à ceux de leurs protons analogues. L’analyse par spectroscopie RMN 13C est également possible : les différentes valeurs de spin de l’hydrogène (1/2) et du deutérium (1) donnent lieu à des multiplicités de fractionnement différentes. La spectroscopie RMN peut être utilisée pour déterminer la deutération spécifique au site des molécules.
Une autre méthode utilise les spectres HSQC. Généralement, les spectres HSQC sont enregistrés à une série de points temporels pendant que l’hydrogène échange avec le deutérium. Comme l’expérience HSQC est spécifique à l’hydrogène, le signal va décroître exponentiellement au fur et à mesure que l’hydrogène s’échange. Il est alors possible d’ajuster une fonction exponentielle aux données et d’obtenir la constante d’échange. Cette méthode donne des informations spécifiques à tous les résidus de la protéine simultanément. L’inconvénient majeur est qu’elle nécessite une affectation préalable du spectre pour la protéine en question. Cela peut demander beaucoup de travail et limite généralement la méthode aux protéines de moins de 25 kDa. Comme l’enregistrement d’un spectre HSQC prend de quelques minutes à quelques heures, les amides qui s’échangent rapidement doivent être mesurés à l’aide d’autres séquences d’impulsions.
Spectrométrie de masseEdit
La spectrométrie de masse par échange d’hydrogène et de deutérium permet de déterminer la teneur globale en deutérium des molécules qui ont subi un échange H/D. En raison de la préparation de l’échantillon requise, on considère généralement qu’elle fournit une mesure précise des atomes d’hydrogène non échangeables uniquement. Elle peut également impliquer un échange H/D en phase gazeuse ou en phase de solution avant l’ionisation. Elle présente plusieurs avantages par rapport à la spectroscopie RMN en ce qui concerne l’analyse des réactions d’échange H-D : beaucoup moins de matériel est nécessaire, la concentration de l’échantillon peut être très faible (jusqu’à 0,1 uM), la limite de taille est beaucoup plus grande et les données peuvent généralement être recueillies et interprétées beaucoup plus rapidement.
Le noyau de deutérium est deux fois plus lourd que le noyau d’hydrogène car il contient un neutron ainsi qu’un proton. Ainsi, une molécule qui contient un peu de deutérium sera plus lourde qu’une molécule qui ne contient que de l’hydrogène. Lorsqu’une protéine est de plus en plus deutériée, sa masse moléculaire augmente en conséquence. La détection du changement de masse d’une protéine lors de la deutération a été rendue possible par la spectrométrie de masse moderne des protéines, rapportée pour la première fois en 1991 par Katta et Chait.
Déterminer la deutération spécifique du site par spectrométrie de masse est plus compliqué que d’utiliser la spectroscopie RMN. Par exemple, l’emplacement et la quantité relative d’échange de deutérium le long du squelette peptidique peuvent être déterminés grossièrement en soumettant la protéine à une protéolyse après que la réaction d’échange ait été éteinte. Les peptides individuels sont ensuite analysés pour déterminer la deutération globale de chaque fragment peptidique. Avec cette technique, la résolution de l’échange de deutérium est déterminée par la taille des peptides produits pendant la digestion. La pepsine, une protéase acide, est couramment utilisée pour la protéolyse, car le pH d’extinction doit être maintenu pendant la réaction protéolytique. Pour minimiser l’échange en retour, la protéolyse et l’analyse ultérieure par spectrométrie de masse doivent être effectuées aussi rapidement que possible. La séparation par CLHP du digestat peptique est souvent effectuée à basse température juste avant la spectrométrie de masse par électrospray pour minimiser le retour d’échange. Plus récemment, l’UPLC a été utilisée en raison de ses capacités de séparation supérieures.
Il a été proposé en 1999 qu’il pourrait être possible d’obtenir une résolution de résidu unique en utilisant la fragmentation par dissociation induite par collision (CID) de peptides deutérés en conjonction avec la spectrométrie de masse en tandem. On a rapidement découvert que la CID provoque un « brouillage » de la position du deutérium dans les peptides. Cependant, la fragmentation produite par la désintégration à la source (ISD), la dissociation par capture d’électrons (ECD) et la dissociation par transfert d’électrons (ETD) de la méthode MALDI se déroule avec peu ou pas de brouillage dans des conditions expérimentales correctes. Le brouillage du marquage isotopique est causé par un échauffement par collision avant la dissociation de l’ion et, bien que la DIC provoque un brouillage, l’échauffement par collision peut également se produire pendant l’ionisation et le transport des ions. Cependant, en optimisant soigneusement les paramètres de l’instrument qui provoquent le chauffage des ions, le brouillage de l’hydrogène peut être minimisé à un degré qui préserve le marquage isotopique en phase de solution jusqu’à ce que la fragmentation puisse être effectuée en utilisant une technique où le brouillage ne se produit pas. Plus récemment, la photodissociation ultraviolette (UVPD) a également été étudiée comme une technique de fragmentation possible pour localiser le deutérium dans les peptides et les protéines. A cet égard, les conclusions ont été mitigées, alors qu’il est possible d’obtenir des fragments UVPD qui n’ont pas subi de brouillage dans certaines conditions, d’autres ont montré que le brouillage peut se produire pour les peptides et les protéines pendant l’étape de fragmentation UVPD elle-même. La théorie actuelle qui consolide ces contradictions apparentes a trait à la double voie de fragmentation qui peut résulter de l’irradiation UV des peptides et des protéines, à savoir la dissociation directe et la dissociation statistique. Autrement dit, si les conditions expérimentales favorisent la dissociation directe et que l’ion précurseur est maintenu à de faibles énergies internes avant et pendant la fragmentation, le niveau de deutérium des fragments résultants correspondra au précurseur non fragmenté. Cependant, les conditions expérimentales peuvent favoriser la dissociation statistique pendant l’irradiation UV, en particulier pour des temps d’irradiation longs et une faible pression de gaz, ce qui entraîne une conversion interne de l’énergie d’excitation électronique apportée par les photons UV. Il en résulte une excitation vibratoire de la molécule irradiée qui subit à son tour un brouillage.
Cristallographie neutroniqueEdit
L’échange hydrogène-deutérium d’espèces à échange rapide (par exemple les groupes hydroxyle) peut être mesuré à une résolution atomique quantitativement par cristallographie neutronique, et en temps réel si l’échange est effectué pendant l’expérience de diffraction.
Les faisceaux de neutrons de haute intensité sont généralement générés par spallation dans des accélérateurs de particules linac tels que la source de neutrons de spallation. Les neutrons diffractent les cristaux de manière similaire aux rayons X et peuvent être utilisés pour la détermination de la structure. Les atomes d’hydrogène, dont le nombre d’électrons est compris entre un et zéro dans un environnement biologique, diffractent peu les rayons X et sont effectivement invisibles dans des conditions expérimentales normales. Les neutrons diffusent à partir des noyaux atomiques, et sont donc capables de détecter les atomes d’hydrogène et de deutérium.
Les atomes d’hydrogène sont couramment remplacés par du deutérium, qui introduit un facteur de diffusion fort et positif. Il est souvent suffisant de remplacer uniquement le solvant et les atomes d’hydrogène labiles dans un cristal de protéine par diffusion de vapeur. Dans une telle structure, l’occupation d’un atome de deutérium échangeable dans un cristal s’affine de 0 à 100 %, quantifiant directement la quantité d’échange.