Identification, caractérisation et vérification des protéines 130 et 131 comme 14-3-3
Figure 1.
Figure 1. Régions des gels colorés à l’argent montrant les taches de protéines 130 et 131 après électrophorèse bidimensionnelle.
Le panneau A montre un liquide céphalo-rachidien normal, avec des taches 130 et 131 absentes. Le panneau B montre le liquide céphalorachidien d’un patient atteint de la maladie de Creutzfeldt-Jakob ; les flèches indiquent les taches 130 et 131. Les gels des panneaux C et D proviennent d’un extrait de cerveau humain normal. Les panneaux A, B et C montrent la même région de gel, avec des points isoélectriques allant de 4,8 à 6,0 (de gauche à droite) sur l’axe x, et des tailles allant de 10 à 40 kd (de bas en haut) sur l’axe y. La boîte en pointillé du panneau C décrit la région illustrée dans le panneau D à partir d’un gel dont le pH est compris entre 4,5 et 5,4. Les flèches des panneaux B et C indiquent l’emplacement des spots 130 et 131, qui sont étiquetés dans le panneau D.
Les résultats de l’électrophorèse bidimensionnelle pour la détection des protéines 130 et 131 du liquide céphalorachidien chez les patients atteints de la maladie de Creutzfeldt-Jakob sont présentés dans la figure 1A et la figure 1B. Des améliorations techniques récentes ont permis d’augmenter la résolution, avec six taches au lieu des deux (correspondant aux protéines 130 et 131) initialement décrites. Afin de trouver une source abondante de ces protéines, nous avons examiné des tissus cérébraux normaux pour déterminer si des protéines cérébrales sont situées près de la constellation de spots correspondant aux protéines 130 et 131 du liquide céphalo-rachidien. La figure 1C montre une région d’un gel coloré à l’argent après électrophorèse bidimensionnelle de protéines cérébrales normales. Plusieurs des protéines apparaissent dans la même zone que la constellation 130-131, dont deux qui ont la même charge et la même masse que la constellation 130-131 du liquide céphalo-rachidien. L’identification de ces deux taches sur la base de leur position a été confirmée par des études de comigration. Le spot 130 a été purifié par électrophorèse bidimensionnelle à gamme étroite (plage de pH, 4,5 à 5,4), comme le montre la figure 1D.
Le spot 130 a été excisé à partir de 10 blots, digéré enzymatiquement et microséquencé. Des séquences d’acides aminés ont été obtenues à partir de quatre fragments peptidiques. Trois de ces séquences, Val-Thr-Glu-Leu-Asn-Glu-Pro-Leu-Xaa-Asn-Glu-Asp-Xaa-Asn-Leu-Leu-Ser-Val-Ala, Asp-Tyr-Tyr-Xaa-Tyr-Leu-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Gly-Glu-Lys, et Asn-Val-Val-Xaa-Ala-Arg-Arg-Ser-Ser-Xaa-Arg-Val-Ile-Ser-Ser-Ile-Glu-Gln, correspondent à la séquence de la protéine 14-3-3 humaine, isoforme eta. La quatrième séquence, Tyr-Ser-Glu-Ala-Xaa-Glu-Ile-Ser, correspondait à la protéine 14-3-3 bovine, isoforme gamma.
L’anticorps 14-3-3 a réagi spécifiquement avec les protéines 130 et 131 du liquide céphalorachidien sur un immunoblot électrophorétique bidimensionnel, mais n’a pas réagi avec d’autres protéines du liquide céphalorachidien, vérifiant ainsi que les protéines 130 et 131 du liquide céphalorachidien sont des protéines 14-3-3.
Immunoessai 14-3-3
Figure 2.
Figure 2. Immunomarquage de l’anticorps polyclonal de lapin anti-14-3-3β après électrophorèse sur gel de polyacrylamide et de dodécylsulfate de sodium.
La voie 1 montre le liquide céphalo-rachidien d’un patient présentant des preuves pathologiques de la maladie d’Alzheimer, les voies 2 et 3 montrent le liquide céphalo-rachidien de deux patients atteints de la maladie de Creutzfeldt-Jakob, la voie 4 montre le liquide céphalo-rachidien d’une vache normale, la voie 5 montre le liquide céphalo-rachidien d’une vache présentant une encéphalopathie de vison transmissible induite expérimentalement et des preuves pathologiques de la maladie spongiforme, le couloir 6 montre un sérum humain normal, le couloir 7 montre un sérum d’un patient atteint de la maladie de Creutzfeldt-Jakob, le couloir 8 montre un extrait de cerveau humain normal, et le couloir 9 montre une protéine prion purifiée provenant du cerveau d’un patient atteint de la maladie de Creutzfeldt-Jakob.
La découverte que les taches 30-kd du liquide céphalorachidien (protéines 130 et 131) sont des protéines 14-3-3 a conduit au développement d’un immunodosage simple pour aider au diagnostic de l’encéphalopathie spongiforme transmissible. Comme le montre la figure 2, le liquide céphalorachidien de patients atteints de la maladie de Creutzfeldt-Jakob présentait une bande immunoréactive 30-kd (voies 2 et 3), alors qu’aucune bande de ce type n’a été détectée dans le liquide céphalorachidien de témoins sains (données non présentées) ou d’un patient atteint de la maladie d’Alzheimer (voie 1). Comme prévu, la protéine 14-3-3 était abondante dans un extrait de cerveau humain normal (voie 8). La protéine 14-3-3 n’a pas été trouvée dans le sérum normal (voie 6) ; cependant, elle n’a pas non plus été détectée dans le sérum de patients atteints de la maladie de Creutzfeldt-Jakob (voie 7). La protéine prion purifiée à partir du cerveau d’un patient atteint de la maladie de Creutzfeldt-Jakob (voie 9) n’a pas eu de réaction croisée avec l’anticorps 14-3-3, ce qui confirme que la 14-3-3 n’est pas une protéine prion.
Tableau 1.
Tableau 1. Échantillons de liquide céphalorachidien évalués avec l’immunodosage 14-3-3, selon le diagnostic. Tableau 2.
Tableau 2. Sensibilité et spécificité de l’immunodosage 14-3-3 pour la maladie de Creutzfeldt-Jakob.
Sixante-huit des 71 échantillons de liquide céphalo-rachidien provenant de patients atteints de la maladie de Creutzfeldt-Jakob (96 pour cent) étaient positifs pour le 14-3-3 (tableau 1 et tableau 2). Quatre des 94 échantillons (4 %) provenant de patients atteints d’autres maladies impliquant une démence étaient positifs pour le 14-3-3 (tableau 1 et tableau 2) (P<0,001). En outre, lorsque les patients atteints de démence dont on sait qu’ils ont subi un infarctus aigu du cerveau dans le mois précédant le test ont été exclus de l’analyse, seul 1 échantillon sur 91 (1 %) était positif (P<0,001). Les échantillons des 10 patients souffrant de démence multi-infarctus mais n’ayant pas subi d’accident vasculaire cérébral dans le mois précédant le test étaient négatifs pour le 14-3-3. Le seul faux résultat positif parmi les échantillons de liquide céphalorachidien des autres patients atteints de démence provenait d’un patient dont le diagnostic clinique de la maladie d’Alzheimer n’avait pas été vérifié par des études pathologiques.
Le 14-3-3 a été détecté dans 18 des 66 échantillons de liquide céphalorachidien (27 %) provenant de patients atteints d’autres maladies neurologiques n’impliquant pas de démence. Les 18 échantillons positifs provenaient de patients atteints d’encéphalite virale aiguë, d’un accident vasculaire cérébral (sans démence) dans le mois précédant le test, d’une hémorragie sous-arachnoïdienne ou du syndrome de Rett. La maladie de Creutzfeldt-Jakob ne pouvait raisonnablement être incluse dans le diagnostic différentiel d’aucun de ces troubles.
Dans l’ensemble, la sensibilité du dosage immunologique 14-3-3 comme marqueur de la maladie de Creutzfeldt-Jakob était de 96 % (68 vrais résultats positifs divisés par 71 vrais résultats positifs et faux résultats négatifs ; intervalle de confiance à 95 %, 92 à 99 %), et la spécificité était de 88 % (164 vrais résultats négatifs divisés par 186 vrais résultats négatifs et faux résultats positifs ; intervalle de confiance à 95 %, 84 à 92 %). Plus important encore, la spécificité de ce test parmi tous les patients atteints de démence était de 96 pour cent (90 vrais résultats négatifs divisés par 94 vrais résultats négatifs et faux positifs ; intervalle de confiance de 95 pour cent, 90 à 96 pour cent), et lorsque les trois patients atteints de démence et d’infarctus cérébral dans le mois précédant le test étaient exclus, la spécificité du test immunologique était de 99 pour cent (90 vrais résultats négatifs divisés par 91 vrais résultats négatifs et faux positifs ; intervalle de confiance de 95 pour cent, 97 à 100 pour cent) (tableau 1 et tableau 2).
Comparaison de l’électrophorèse bidimensionnelle et du dosage immunologique
Tableau 3.
Tableau 3. Comparaison de l’électrophorèse bidimensionnelle pour les protéines 130 et 131 et de l’immunoessai 14-3-3.
Nous avons comparé le dosage électrophorétique bidimensionnel pour les protéines 130 et 131 avec le dosage immunologique 14-3-3 dans 50 échantillons de liquide céphalo-rachidien (tableau 3). Treize des 15 échantillons provenant de patients atteints de la maladie de Creutzfeldt-Jakob étaient positifs avec les deux tests, et les 2 autres échantillons étaient négatifs pour les protéines 130 et 131 mais positifs pour la protéine 14-3-3. Les résultats des deux tests étaient les mêmes dans les échantillons de patients atteints de démence non associée à la maladie de Creutzfeldt-Jakob ou à d’autres troubles neurologiques. Bien que les spécificités des deux tests soient similaires, l’immunodosage de la 14-3-3 a une sensibilité légèrement supérieure.
Immunodosage de la 14-3-3 chez les animaux
Tableau 4.
Tableau 4. Résultats de l’essai immunologique 14-3-3 dans les échantillons de liquide céphalo-rachidien des animaux.
Les résultats des études sur les animaux étaient cohérents avec ceux des études sur les humains. La figure 2 montre les résultats du dosage dans le liquide céphalo-rachidien d’une vache normale (voie 4) et d’une vache présentant des signes pathologiques d’encéphalopathie spongiforme transmissible (voie 5). Comme le montre le tableau 4, la protéine 14-3-3 a été détectée dans le liquide céphalo-rachidien de six des neuf bovins atteints d’encéphalopathie transmissible du vison ou de tremblante du mouton induite expérimentalement. La seule vache présentant des caractéristiques cliniques mais aucune preuve pathologique d’encéphalopathie spongiforme transmissible a également eu un test positif. Aucun bovin témoin n’a eu de test positif. Le test était positif chez cinq des six moutons atteints de la tremblante naturellement acquise et était négatif chez le seul mouton témoin. Les 15 chimpanzés infectés expérimentalement ont tous eu des tests positifs, alors qu’aucun des 77 chimpanzés témoins n’en a eu. La sensibilité globale du test immunologique 14-3-3 chez les animaux était de 87 %, et la spécificité globale était de 99 %.