La zone préoptique médiale chez la souris est capable de médier des comportements sexuellement dimorphiques indépendamment du sexe

Animaux

Les animaux C57BL/6J ont été achetés au Jackson Laboratory, Slac Laboratory Animal (Shanghai) et élevés en interne. Esr1-2a-Cre (Esr1Cre, #017913) et Vglut2-Ires-Cre (Vglut2Cre, #012569) ont été achetés au Jackson Laboratory. La lignée Vgat-Cre (VgatCre) a été générée précédemment68. Toutes les lignées Cre ont été croisées sur un fond C57BL/6J pendant au moins une génération. Les animaux ont été hébergés dans l’animalerie de l’Institut des neurosciences selon un cycle lumière/obscurité de 12 h:12 h avec de la nourriture et de l’eau ad libitum. Seuls les animaux hétérozygotes des allèles Cre ont été utilisés dans l’étude. Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Institut des neurosciences, Académie chinoise des sciences, Shanghai, Chine (IACUC n° NA-016-2016).

Chirurgie

Les souris adultes âgées de 2 à 4 mois ont été anesthésiées à l’isoflurane (0,8-5%) et placées dans un cadre stéréotaxique (David Kopf Instrument, modèle 1900). Une pommade ophtalmique a été appliquée pour prévenir la déshydratation. Le crâne a été exposé par une petite incision et des trous ont été percés pour injecter le virus avec des pipettes en verre (15-25 μm de diamètre à l’extrémité) et pour implanter des fibres optiques. Les coordonnées pour l’administration du virus dans l’AOMP étaient AP, -0,16 mm ; ML, ±0,4 mm ; DV, -5,150 mm (atlas du cerveau de la souris de Paxios et Franklin, 2e édition). 100-400 nl de virus ont été injectés par côté à un débit de 70 nl par minute en utilisant un injecteur nanolitre fait maison ou à 40 nl par minute en utilisant une pompe hydraulique (Harvard Apparatus). Les pipettes en verre ont été laissées en place pendant environ ~10 min après l’injection avant d’être rétractées. Des fibres mono optiques (diamètre, 200 μm ; N.A., 0,37 ; longueur, 6 mm ; AniLab Software and Instruments Co., Ltd) ou des fibres optiques doubles (DFC_200/245-0,37_6,0mm_DF0,9_FLT ; Doric Lense) ont été placées 400 μm au-dessus du site d’injection du virus pour les expériences optogénétiques ou 50 μm au-dessus pour les enregistrements de photométrie par fibre. Les fibres optiques ont été fixées avec du ciment dentaire et des vis crâniennes. Les compagnons de portée ont été choisis au hasard pour recevoir une injection de virus expérimental ou de contrôle. Les chirurgies de castration ont été réalisées avec des animaux anesthésiés par injection intrapéritonéale (i.p.) de kétamine (80 mg kg-1) et de xylazine (8 mg kg-1). Les animaux ont été autorisés 3-4 semaines pour récupérer après les chirurgies avant les tests comportementaux ultérieurs.

Virus

Tests comportementaux

Tous les tests comportementaux ont été initiés au moins une demi-heure après le début du cycle de l’obscurité, et ont été enregistrés à l’aide d’une caméra infrarouge à une fréquence d’images de 25 Hz et notés par des expérimentateurs aveugles au génotype, à l’information sur le groupe ou au statut de photostimulation des animaux impliqués. Tous les animaux testés pour leurs comportements, à l’exception de ceux utilisés dans les expériences d’inhibition optogénétique, étaient des souris vierges naïves avant le test. Dans les expériences d’inhibition optogénétique, toutes les souris mâles ont été hébergées avec des souris femelles et certaines d’entre elles sont devenues pères avant le test, tandis que certaines femelles ont été hébergées avec des petits, ou accouplées pour devenir mères, ou traitées avec des semaines d’injection de testostérone avant le test. À l’exception des animaux utilisés dans les expériences d’activation optogénétique, tous les animaux ont été hébergés individuellement 3 à 7 jours avant les tests comportementaux.

Pour les tests de comportement d’accouplement, une femelle C57BL/6 ovariectomisée amorcée hormonalement a été introduite dans la cage d’origine et filmée pendant 30 min. Les tests de comportement d’accouplement ont été répétés trois fois avec différents animaux stimulus à au moins trois jours d’intervalle. Le comportement parental a été testé en dispersant trois chiots âgés de P1 à P4 sur le bord du nid et en filmant l’animal pendant ~15 minutes. Les tests ont été répétés 2 à 3 fois. L’agression territoriale a été testée en introduisant une souris intruse de tache Balb/c achetée chez Slac Laboratory Animal (Shanghai) dans la cage d’origine de l’animal testé et en l’enregistrant sur vidéo pendant ~15 min.

Les vidéos ont été annotées manuellement sur une base image par image en utilisant un programme MATLAB écrit sur mesure comme décrit précédemment8. Les comportements ont été notés selon les critères suivants : les contacts nez à visage, nez à corps ou nez à organes génitaux initiés par les animaux testés sont notés collectivement comme  » enquête sociale « , dont le contact nez à organes génitaux est spécifiquement défini comme  » chimio-investigation « , également appelé  » sniff « . La « montée » est notée lorsque l’animal expérimental place ses membres antérieurs sur le dos du stimulus, grimpe dessus et bouge le bassin. Les mouvements rythmiques du bassin après la montée sont notés comme « poussée pelvienne ». Les actions initiées par le résident vers un intrus mâle, y compris les fentes, les morsures, les culbutes, sont notées comme des « attaques ». Le  » contact avec le chiot  » est noté lorsqu’un animal a touché un chiot avec son nez ou sa bouche. « Récupération du petit » est noté lorsqu’un animal tient le petit avec sa bouche et se déplace, généralement vers le nid. L' »accroupissement » est noté lorsque l’animal arque son dos et plane au-dessus des petits dans le nid. Les petits ont toujours été inspectés après l’essai comportemental pour détecter d’éventuelles blessures. Environ 2 % des essais comportementaux ont donné lieu à des blessures chez les petits. L’exclusion de ces essais n’a influencé aucune conclusion.

Activation optogénétique

Les animaux utilisés pour les expériences optogénétiques étaient logés en groupe. Le jour du test comportemental, ils ont été introduits dans une cage fraîche. Une fibre optique externe a été utilisée pour connecter une source d’énergie laser de 473 nm (Shanghai Laser and Optics Century Co. ou Changchun New Industries Optoelectronics Tech Co., Ltd.) à la fibre optique implantée dans l’animal. La fibre optique externe a été fixée à une articulation rotative (FRJ_1 × 1_FC_FC, Doric Lense) pour permettre à l’animal de se comporter librement. L’animal testé a été autorisé à explorer la cage pendant environ 15 minutes avec la fibre externe fixée. Ensuite, un programme MATLAB personnalisé a été lancé pour contrôler un Master 9 (A.M.P.I.), qui a envoyé un déclencheur pour initier l’enregistrement à partir de la caméra et des signaux au laser pour délivrer 15 s de photostimulation à 40 Hz 12 mW ou 20 Hz 5 mW, espacés de 90-120 s au hasard. La puissance du laser a été ajustée pour chaque animal en fonction de l’efficacité de la transitivité de la luminance de la fibre optique implantée, mesurée avant l’implantation, afin de garantir la puissance de la lumière émise à l’extrémité de la fibre. Pendant la stimulation laser, les animaux étaient soit testés seuls pour la locomotion, soit avec une femelle ovariectomisée à amorçage hormonal, un mâle C57BL/6, un jeune rat âgé de P13-P15, des petits âgés de P1-P4, ou des blocs de caoutchouc de taille similaire à celle des petits comme stimulus. Cinq à douze stimulations ont été administrées au cours de chaque essai. Quatre essais avec chaque stimulus (espacés de 3 à 5 minutes) ont été réalisés un jour donné pour chaque animal. Après l’achèvement de tous les tests comportementaux, les animaux ont reçu des trains de photostimulation (15 s, 12 mW, 40 Hz, 10 fois, un intervalle fixe de 105 s) et ont été perfusés transcardialement avec du paraformaldéhyde à 4 % une heure après la stimulation lumineuse pour une analyse histologique. Du sang a également été prélevé au moment de la mise à mort pour les mesures hormonales.

Photométrie des fibres

Les animaux utilisés pour les expériences de photométrie des fibres ont été logés individuellement 3 à 7 jours avant les tests comportementaux. Le jour du test, la fibre optique implantée a été connectée au F-scope (Biolink Optics Technology Inc., Beijing), une installation d’enregistrement de photométrie par fibre intégrée, par le biais d’une fibre optique externe. Dans le F-scope, un laser d’excitation de 488 nm (OBIS 488LS ; Coherent) est réfléchi par un miroir dichroïque (MD498, Thorlabs). Les signaux d’émission collectés par la fibre optique implantée sont filtrés avec un filtre passe-bande (MF525-39, Thorlabs) et dirigés sur un tube photomultiplicateur (PMT, R3896, Hamamatsu). Pendant les enregistrements, la puissance du laser a été ajustée pour chaque animal en fonction de l’efficacité de la transitivité de la luminance de la fibre optique implantée pour s’assurer que la lumière émise à l’extrémité de la fibre était de ~30 μw et le gain de tension du PMT a été réglé à 500 v pour les animaux GCamp6s et 300-350 v pour les animaux témoins. Une fois démarré, le logiciel F-scope a envoyé un signal de déclenchement pour initier l’enregistrement vidéo à partir de la caméra infrarouge. Les signaux d’émission ont été filtrés en passe-bas à 30 Hz et échantillonnés à 500 Hz avec une carte d’acquisition de données (USB6009, National Instrument) utilisant un logiciel fourni par Biolink Optics. Pour un essai donné, les animaux ont d’abord été autorisés à explorer pendant environ 5 minutes, au cours desquelles les signaux de base ont été enregistrés. Ensuite, un stimulus tel qu’une femelle ovariectomisée amorcée hormonalement, un faux jouet de souris en plastique, des chiots d’âge P1-P4 ou des blocs de caoutchouc de taille similaire à celle des chiots ont été introduits. Les animaux ont été autorisés à interagir et à se comporter avec les stimuli pendant 15-90 min avant le retrait des stimuli, après quoi les signaux ont été enregistrés pendant encore ~5 min.

Inhibition optogénétique

Les animaux utilisés pour les expériences d’inhibition optogénétique étaient logés individuellement. Les souris mâles ont été hébergées conjointement avec des femelles pour être expérimentées sexuellement ou pour devenir pères avant les tests. Les souris femelles vierges ont été testées comme des animaux naïfs pour l’accouplement typique des mâles et pour les comportements maternels. Si les comportements maternels de base étaient médiocres lors du test initial, elles étaient hébergées avec les petits pendant la nuit et testées à nouveau pour les comportements maternels. Après le test des comportements maternels, certaines femelles ont été traitées tous les deux jours par injection sous-cutanée de testostérone (100 μg dans 50 μl d’huile de tournesol, Shanghai Pharm.) pendant environ 3 semaines avant d’être à nouveau testées pour l’accouplement mâle-typique. Les femelles testées comme mères ont été accouplées après l’injection virale pour produire leurs propres petits.

Avant le test comportemental, un cordon de raccordement à double fibre optique (DFP_200/230/900-0,37_1m_DF0,9_2FCM, Doric Lense) a été utilisé pour connecter une source d’alimentation laser de 473 nm (Shanghai Laser and Optics Century Co. ou Changchun New Industries Optoelectronics Tech Co, Ltd.) à la double fibre optique implantée (DFC_200/245-0.37_6.0mm_DF0.9_FLT, Doric Lense) dans l’animal via une articulation rotative (FRJ 1 × 2i FC-2FC 0.22, Doric Lense) pour permettre à l’animal de se comporter librement. Après ~10 min d’habitation, la caméra a été déclenchée pour enregistrer le processus comportemental par un signal envoyé par Master 9, qui a été contrôlé par un programme MATLAB écrit sur mesure. Pour délivrer la lumière après l’approche, la lumière (~12 mW) a été automatiquement déclenchée pour être délivrée en continu aussi longtemps que les positions de l’animal testé ont été détectées par le programme pour être à moins d’une longueur de corps de la femelle ovariectomisée amorcée hormonalement dans les tests de comportement d’accouplement ou dans la région des petits, qui a été définie en marquant une zone légèrement plus grande entourant chaque petit dispersé dans les tests de comportement maternel. Au moins deux essais avec lumière et deux essais sans lumière ont été effectués alternativement pour chaque test. Pour délivrer des lumières après le déclenchement de comportements définis, une lumière bleue (~12 mW) de durée fixe (5 ou 10 s) était déclenchée manuellement lorsque l’expérimentateur observait le comportement d’intérêt en temps réel. Un ou deux essais de lumière ont été effectués alternativement pour chaque test.

Immunocoloration fluorescente

Les animaux ont été anesthésiés avec de l’hydrate de chloral à 10% et perfusés transcardialement avec du PBS suivi de paraformaldéhyde (PFA) à 4% glacé dans du PBS. Ensuite, les cerveaux ont été sectionnés à 40 μm d’épaisseur à l’aide d’un vibratome (VT1000S, Leica). Les sections ont été divisées également en plusieurs ensembles et traitées pour la coloration ou montées directement. Les sections de cerveau ont été bloquées dans du sérum de chèvre à 5 % dans de l’AT (0,1 % de Triton et 2 mM MgCl2 dans du PBS) pendant 1 h à température ambiante et incubées pendant la nuit à 4 °C dans de l’AGT (0,5 % de sérum de chèvre normal, 0.1% Triton et 2 mM MgCl2 dans PBS) contenant l’anticorps primaire approprié (lapin anti-c-Fos, 1:2000, Santa Cruz, Cat# sc-52 ; lapin anti-Esr154, 1:10,000, Millipore, Cat# 06-935). Le jour suivant, les sections de cerveau ont été lavées avec de l’AGT trois fois (30 min chacune) et incubées avec les anticorps secondaires appropriés (Alexa Fluor 488 conjugué, 1:1000 ; Cy3 conjugué, 1:1000, Jackson ImmunoResearch) à température ambiante pendant 2 h. Les sections de cerveau ont été contre-colorées avec Neuro Trace (Life Technologies, Cat# N21479, 1:300) ou DAPI (5 mg ml-1, 1:1000, Sigma) dans l’AT. Après plusieurs lavages dans l’AGT, l’AT et le PBS, les sections de cerveaux ont été montées sur des lames de verre.

Coloration au DAB

Les sections de cerveaux ont été préparées de la même manière que les expériences d’immunomarquage par fluorescence et ont été prétraitées avec 3% de H2O2 pendant 30 min à température ambiante pour bloquer la peroxydase endogène, lavées deux fois pendant 10 min chacune dans du PBST (0.3% Triton X-100 dans PBS), bloquées avec 5% de sérum de chèvre dans PBST pendant 2 h à température ambiante, et incubées avec l’anticorps primaire anti-c-Fos (Rabbit anti-c-fos, 1:2000, Santa Cruz, Cat# sc-52) dans PBST pendant une nuit à 4 °C. Le jour suivant, les sections ont été lavées six fois dans du PBST, 10 minutes chacune, puis incubées avec l’anticorps secondaire anti-lapin de chèvre conjugué à la biotine (Cat#111-065-003, Jackson ImmunoResearch) dans du PBST pendant 2 heures à température ambiante. Après trois lavages dans du PBS, 5 min chacun, les coupes de cerveau ont été colorées avec le réactif VECTASTAIN® ABC pendant 30 min en suivant le manuel du fabricant. Après deux lavages de 5 minutes dans du PBS, les sections de cerveau ont été incubées dans une solution de 3,3-diaminobenzidine (Cat# D5637-5G, Sigma) avec une intensification au nickel jusqu’à l’obtention de l’intensité de coloration souhaitée. La réaction a été arrêtée en rinçant les sections dans l’eau du robinet. Les sections de cerveau ont été montées sur des lames de verre et capturées sous des objectifs ×4 ou ×10 avec des microscopes optiques conventionnels.

Hybridation in situ

Les modèles d’ADN pour générer des sondes in situ ont été clonés en utilisant les ensembles d’amorces suivants pour chaque gène correspondant : Vgat, 5′-gccattcagggcatgttc-3′ et 5′-agcagcgtgaagaccacc-3′ ; Vglut2, 5′-atcgactagtccaaatcttacggtgctacctc-3′ et 5′-atcgctcgagtagccatctttcctgttccact-3′ ; Cre, 5′- ccaatttactgaccgtacacca-3′ et 5′-tatttacattggtccagccacc-3′ ; GAD1, 5′-cattgaggatagaggttg-3′ et 5′-agagaagcgaaggctact-3′ ; Galanin, 5′-atcctgcactgaccagcc-3′ et 5′-ttggcttgaggagttggc-3′. Les sondes d’ARN antisens ont été transcrites avec l’ARN polymérase T7 (Promega, Cat# P207E) et des nucléotides marqués à la digoxigénine (DIG). Les animaux ont été anesthésiés avec de l’hydrate de chloral à 10 % et perfusés par voie transcardiaque avec du PBS traité au DEPC (D-PBS), puis avec du paraformaldéhyde (PFA) glacé à 4 % dans du D-PBS. Ensuite, les cerveaux ont été sectionnés à 40 μm d’épaisseur à l’aide d’un vibratome (VT1000S, Leica). Les sections de cerveau ont été lavées dans un tampon 2XSSC contenant 0,1 % de triton pendant 30 min, acétylées dans de la triéthanolamine 0,1 M (pH 8,0) avec 0,25 % d’anhydride acétique (vol/vol) pendant 10 min, équilibrées dans une solution de pré-hybridation pendant 2 h à 65 ℃, puis incubées avec 0,5 μg ml-1 de sondes d’ARN spécifiques dans un tampon d’hybridation pendant une nuit à 65 ℃. Le jour suivant, les sections ont été rincées dans la solution de pré-hybridation et dans la solution de pré-hyb/TBST (TBS avec 0,1 % de tween-20) pendant 30 min chacune. Ensuite, les sections ont été lavées avec du TBST pendant deux fois et du TAE pendant trois fois, chacune pendant 5 min. Les sections ont ensuite été transférées dans des puits de gel d’agarose à 2%, qui ont été passés dans 1XTAE à 60 V pendant 2 h pour éliminer les sondes non hybridées. Les sections ont ensuite été lavées deux fois dans du TBST, puis incubées avec un anticorps anti-digoxygénine-AP de mouton (1:2000, Roche, Cat# 11093274910), parfois avec un anticorps anti-Esr1 de lapin (1:3000, Millipore, Cat# 06-935) à des fins de coloration conjointe, dans un réactif de blocage à 0,5 % (Roche, 11096176001) à 4 °C pendant une nuit. Le deuxième jour, pour la coloration en fond clair, les sections ont été lavées et colorées avec du NBT (Roche, Cat# 11383213001) et du BCIP (Roche, Cat# 11383221001) pendant 4-10 h à 37 ℃. Pour l’hybridation in situ fluorescente combinée à l’immunohistochimie, les sections ont d’abord été colorées avec des anticorps secondaires fluorescents, puis avec du rouge rapide (HNPP Fluorescent Detection Set, Roche, Cat# 11758888001) et une contre-coloration avec du DAPI (5 mg ml-1, 1:1000, Sigma) dans du PBS. Toutes les sections ont été lavées après la coloration et montées sur des lames de verre. Les images ont été capturées avec un objectif ×20 en utilisant un microscope conventionnel ou confocal.

catFISH

La plupart des animaux utilisés dans l’expérience catFish étaient expérimentés. Pour la procédure, les animaux ont eu droit à deux épisodes de 5 minutes d’interactions sociales avec une femelle ovariectomisée amorcée hormonalement ou des petits dispersés, à 30 minutes d’intervalle. Immédiatement après le deuxième épisode, les animaux ont été anesthésiés avec de l’hydrate de chloral à 10 % et perfusés transcardialement avec du DEPC-PBS suivi de PFA glacé à 4 % dans du PBS. Les cerveaux ont été disséqués et post-fixés pendant une nuit à 4 °C et déshydratés avec 30 % de saccharose dans du DEPC-PBS. Ensuite, les cerveaux ont été sectionnés à 20 μm d’épaisseur et montés sur des lames SuperFrost Plus® (Fisher Scientific, n° de cat. 12-550-15). Après séchage à l’air, les lames ont été stockées à -80 °C avant d’être traitées conformément au manuel d’utilisation du kit de réactifs fluorescents RNAscope® Multiplex v2 (ACD Bio.). Les sondes contre l’intron c-Fos, l’ARNm c-Fos et Esr1 ont été commandées à ACD Bio. et utilisées dans l’expérience. Les images ont été capturées sous un objectif ×60 en utilisant un microscope confocal.

Enregistrements électrophysiologiques

Les animaux C57BL/6 injectés avec des AAV codant pour le ChR2-mCherry dans l’AMPO ou les souris Esr1Cre injectées avec des AAV codant pour le GtACR1 ont été anesthésiés avec de l’isoflurane et perfusés de manière transcardiaque avec une solution de saccharose élevée oxygénée glacée (95% O2/5% CO2) (composition en mM : 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 2 Na2HPO4, 2 MgSO4, 213 saccharose, 26 NaHCO3). Après dissection du cerveau, des sections coronales incluant l’AOMP ont été coupées à 250 μm à l’aide d’un vibratome (VT-1200S, Leica) dans une solution de coupe oxygénée glacée. Les tranches de cerveau ont ensuite été incubées dans du liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF ; composition en mM : 126 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 2 MgSO4, 10 glucose, 26 NaHCO3, 2 CaCl2) à 34 °C pendant au moins 1 h et enregistrées à température ambiante. Les cellules ont été identifiées au microscope à fluorescence et visualisées par contraste interférentiel différentiel infrarouge (BX51, Olympus). Les enregistrements de clampage de courant de cellules entières ont été réalisés avec un amplificateur MultiClamp700B et une interface Digidata 1440A (Molecular Devices). L’électrode de patch-clamp (5-8 MΩ) a été remplie d’une solution intracellulaire (composition en mM : 120 K-gluconate, 4 KCl, 10 HEPES, 10 phosphocritine de sodium, 4 Mg-ATP et 0,3 Na3-GTP, pH:7,3, 265 mOsm). Pour l’activation optogénétique, de la lumière bleue (473 nm, 10 ms de largeur, 14 mw mm-2, 40 impulsions) a été délivrée sur les tranches à travers un objectif ×40 en utilisant une source de lumière LED X-Cite (Lumen Dynamics). La fidélité des pointes dans les neurones exprimant ChR2 a été mesurée en comptant le nombre d’impulsions lumineuses qui ont réussi à provoquer des potentiels d’action à différentes fréquences. La moyenne de la fidélité des pointes a été calculée sur cinq stimulations et représentée graphiquement. Pour l’inhibition optogénétique, le potentiel d’action des neurones exprimant GtACR1 a été induit en retenant le potentiel de membrane -48 mW avec une injection de courant et une lumière bleue continue répétée a été délivrée sur les tranches.

Imagerie calcique dans les tranches de cerveau

Des AAV codant pour ChR2 et des AAV codant pour GCamp6s, tous deux pilotés par hSyn, ont été co-injectés dans le mPOA d’animaux C57BL/6. Des tranches de cerveau aiguës comprenant le MPOA ont été préparées de la même manière que les procédures électrophysiologiques décrites ci-dessus. L’imagerie calcique a été réalisée à l’aide d’un microscope à balayage laser à deux photons (Ultima, Prairie Instruments Inc.) avec un objectif à immersion dans l’eau 20X/0,95-NA XLUMPLFL (Olympus). Le laser Ti:saphir était réglé à 940 nm, et des images de 512 × 512 pixels ont été acquises à travers un filtre d’émission 525/70 nm à une fréquence de 1,2 Hz. Des trains aléatoires de lumière de 470 nm (impulsion de 10 ms, 15 s, 8,4 mW mm-2) de différentes fréquences (10 Hz, 20 Hz, 40 Hz) ont été délivrés aux tranches à des intervalles de ~2 min. Les images ont été analysées en utilisant ImageJ.

Dosages hormonaux

Le sang du tronc a été collecté au moment de la mise à mort avant la perfusion. Le sérum a été préparé. Les titres d’hormones ont été dosés à l’aide d’un kit ELISA de testostérone (DRG Instruments GmbH, Allemagne, Division de ARG international, Inc, Cat# EIA-1559) selon les protocoles du fabricant.

Analyse des données

Tous les codes ont été écrits en MATLAB et utilisés pour l’analyse des données, et sont disponibles sur demande. Aucun calcul de la taille de l’échantillon n’a été effectué. Le nombre de cellules enregistrées dans la tranche ou comptées dans la coloration et le nombre d’animaux utilisés pour les tests comportementaux et la coloration ont été choisis en fonction de la littérature publiée d’expériences similaires. Les points de données des animaux qui, après analyse histologique post hoc, ont été considérés comme des ratés selon des critères préétablis ont été exclus de l’analyse. Au total, trois souris Esr1Cre femelles et une souris Esr1Cre mâle injectées avec GtACR1, une souris VgatCre mâle et femelle et une souris Esr1Cre femelle injectée avec Casp3 ont été exclues de l’analyse.

Pour analyser les données des expériences d’imagerie du Ca2+ dans les tranches de cerveau, les images ont été quantifiées dans ImageJ. Brièvement, les cellules GCaMP6s+ ont été soulignées manuellement et les changements de fluorescence relatifs (ΔF/F) ont été calculés pour chaque cellule avec l’équation ΔF/F = (F-F0)/F0, dans laquelle F0 est l’intensité moyenne des pixels dans les 10 dernières images avant la photostimulation et F est l’intensité moyenne des pixels dans les 6 premières images après la photostimulation. Les images acquises pendant les périodes de photostimulation ont été exclues de l’analyse. Une cellule activée a été définie de manière opérationnelle comme des cellules présentant une augmentation de ΔF/F qui s’éloignait de 5 écarts types des valeurs moyennes de ΔF/F mesurées dans 30 images avant la première photostimulation.

Pour analyser la locomotion provoquée par la lumière, les traces de mouvement ont d’abord été extraites à l’aide de codes MATLAB personnalisés, qui reconnaissent le centroïde d’un animal. La vitesse de mouvement a ensuite été calculée dans des tranches de temps de 1 s en mesurant la distance parcourue. Les 15 points de données de vitesse de mouvement pendant une période de photostimulation ont été comparés aux 15 points précédents pour vérifier si la stimulation lumineuse a induit une augmentation de la vitesse dans cet essai. Au niveau de l’animal, les moyennes des vitesses de mouvement pendant chaque période de photostimulation ont été comparées aux moyennes des vitesses de mouvement immédiatement avant chaque période de photostimulation pour déterminer si la locomotion induite par la lumière augmente chez cet animal. Pour le montage et la récupération des petits induits par l’optogénétique, les vidéos ont d’abord été évaluées en aveugle. Les enregistrements vidéo ont ensuite été alignés sur les enregistrements de photostimulation pour extraire le pourcentage d’essai, la latence d’apparition et la durée totale des comportements évoqués. Seuls les comportements qui se sont produits pendant la stimulation lumineuse ont été comptés comme des comportements induits par optogénétique. Si un comportement s’est produit avant la période de photostimulation, mais néanmoins pendant celle-ci, il n’a pas été compté comme comportement optogénétiquement induit. La moyenne des paramètres a toujours été calculée pour toutes les périodes de photostimulation d’un même essai comportemental, puis pour tous les essais s’il y en avait plusieurs. Pour tracer la distribution temporelle des comportements évoqués par optogénétique, seules les périodes de photostimulation au cours desquelles les comportements se sont produits ont été utilisées pour établir la moyenne. Dans les essais comportementaux avec un mâle, un jeune rat ou de faux petits ont été utilisés comme stimulus ou lorsque les animaux ChR2 ont été castrés, les comportements induits par optogénétique ont été comparés aux comportements spontanés qui se sont produits dans la période de 15 s précédant immédiatement les périodes de photostimulation.

Pour analyser l’effet de l’inhibition optogénétique sur un comportement spécifique, les vidéos ont d’abord été notées en aveugle. Les journaux vidéo ont ensuite été alignés sur les journaux de photostimulation pour extraire les événements de comportement qui ont rencontré la stimulation lumineuse. Pour tracer divers paramètres de comportements spécifiques, les événements comportementaux ayant rencontré une stimulation lumineuse ont été moyennés au niveau de l’essai si plusieurs essais existaient, puis au niveau de l’animal. Pour tracer la distribution de l’accumulation de comportements spécifiques, seuls les événements comportementaux qui ont rencontré une stimulation lumineuse ont été analysés.

Pour simuler un centre d’activation pour un animal ChR2, une zone de 1100×1500 μm avec un côté proche de la ligne médiane et le côté perpendiculaire proche du fond du cerveau a été rognée de chaque section coronale du cerveau et a été redimensionnée à 1 μm par pixel. Les signaux c-Fos dans chaque 100×100 μm ont été extraits de manière semi-automatique à l’aide du programme MATLAB avec ImageJ et additionnés dans une matrice 11 × 15 en fonction de leurs emplacements dans chaque section. Le nombre moyen de cellules NeuN/HuCD+ dans un carré de 100 μm2 a été estimé à ~25. Pour calculer les coordonnées du centre d’activation le long de l’axe latéral-médial et dorso-ventral, les nombres au sein de la matrice 11 × 15 ont été moyennés sur une série de sections cérébrales qui s’étendaient antérieurement et postérieurement pour chaque animal et ajustés avec une fonction gaussienne à deux dimensions dans MATLAB. Pour calculer la coordonnée antéro-postérieure du centre d’activation, le nombre total de c-Fos a été additionné pour chaque section de cerveau et ajusté avec une seule fonction gaussienne.

Pour les expériences de photométrie par fibre, les signaux de fluorescence bruts ont été encore ajustés selon la tendance générale pour tenir compte du photoblanchiment. Les essais présentant une gigue, des ondes carrées de signaux ou un rapport signal/bruit extrêmement faible ont été exclus de la suite de l’analyse. Pour la réponse initiale, les valeurs de changement de fluorescence (ΔF/F) ont été obtenues en calculant (F-F0)/F0, où F0 est la médiane du signal de fluorescence de base. Pour les signaux de fluorescence alignés sur les comportements, les données ont été segmentées en fonction des événements comportementaux au sein des essais individuels et les signaux moyens 10-15 s avant le début du comportement ont été utilisés comme F0. Pour analyser la signification statistique des deux signaux de fluorescence liés aux événements, un test t avec un taux de fausse découverte (FDR) de 0,05 a été utilisé. Pour établir une corrélation entre les transitoires Ca2+ et les comportements, un événement Ca2+ progressif a été compté lorsque les valeurs ΔF/F étaient supérieures de 3 déviations standard à la ligne de base et duraient plus de 2 s. Le nombre d’événements Ca2+ a été compté entre le premier et le dernier comportement et corrélé avec le nombre d’événements comportementaux pendant cette période. Seuls les essais comportementaux qui comportaient plus de deux montages et plus d’une récupération ont été utilisés pour l’analyse de corrélation.

Les images histologiques ont été capturées avec un objectif ×20 sur un microscope confocal, sauf indication contraire. Les images ont été traitées et comptées dans ImageJ avec des codes MATLAB écrits sur mesure. Tous les comptages ont été effectués par des expérimentateurs aveugles au sexe ou à la condition de test de l’animal. Pour analyser l’expression virale de ChR2, le co-marquage de ChR2, c-Fos et Nissl dans la zone d’injection centrale a été compté manuellement. Pour analyser le co-marquage de Esr1 et Vglut2, Vgat ou Galanin, cinq zones relativement fixes dans cinq sections de cerveau de positions similaires ont été sélectionnées pour être comptées manuellement. Pour tester la spécificité de l’expression de Cre chez les animaux Esr1-cre, le co-marquage de Esr1 et de Cre a été compté manuellement dans différentes zones de plusieurs coupes obtenues à partir d’un animal. Pour quantifier les images des expériences catFISH, qui ont été prises sous un objectif ×60, les cellules positives pour c-Fos cytoplasmique ou nucléaire et pour Esr1 ont été reconnues avec du DAPI comme contre-coloration et comptées manuellement. Afin de quantifier les effets de l’ablation virale des neurones Esr1+, les signaux Esr1+ dans le mPOA tel que défini par le Allen Brain Atlas ont été comptés pour les deux côtés en utilisant une stéréologie non biaisée avec le logiciel Stereo Investigator (MBF bBioscience). Plus précisément, à l’aide d’une sonde de fractionnement optique, les signaux Esr1+ ont été dénombrés dans une boîte de comptage de 30×30 μm dans une grille d’échantillonnage de 100×100 μm. Pour quantifier les effets de l’ablation virale des neurones Vgat+ ou Vglut2+, des sections de cerveau ont été imagées avec un objectif ×10 via Olympus VS120. Les zones qui se sont colorées avec des signaux Vgat+ ou Vglut2+ dans l’AMPO et les régions adjacentes ont été extraites de manière semi-automatique en utilisant des codes MATLAB.

Statistiques

Pour les graphiques à barres, les données sont présentées sous forme de moyenne ± s.e.m. Dans les diagrammes en boîte et moustaches, les données sont présentées sous forme de moustaches min à max et la moyenne indiquée par « + » et la médiane indiquée par une ligne horizontale. Sauf indication contraire, les tests statistiques suivants ont été effectués et tous les tests ont été spécifiés comme bilatéraux. Les données catégorielles ont été analysées par le test exact de Fisher. Les données appariées ont été analysées par le test des paires. Pour analyser la différence statistique de la distribution d’accumulation, le test de Kolmogorov-Smirnov à deux échantillons a été utilisé. Les données avec une variable indépendante ont été analysées par des ANOVA à sens unique suivies d’un test post hoc avec correction de Bonferroni. Les données avec deux variables indépendantes ont été analysées par des ANOVA à deux voies suivies d’un test post hoc avec correction de Bonferroni. Pour les autres comparaisons, la distribution des données a été testée à l’aide du test de normalité de Lilliefors. Si les données passaient le test de normalité, un test paramétrique (test t de Student) était utilisé. Sinon, le test non paramétrique de la somme des rangs de Wilcoxon a été utilisé. La valeur p et le coefficient de corrélation pour la corrélation de Pearson ont été calculés en utilisant une distribution t de Student pour une transformation de la corrélation. *p < 0,05, **p ≤ 0,01, ***p < 0,001.

Disponibilité des données

Toutes les données de cette étude sont disponibles sur demande.