Les analyses de co-immunoprécipitation monomoléculaire en temps réel révèlent une dynamique de signalisation Ras spécifique au cancer

Imagerie en temps réel de la co-IP monomoléculaire

Nous montrons d’abord que la cinétique d’une interaction protéine-protéine peut être mesurée dans des extraits cellulaires au niveau monomoléculaire (Fig. 1). Comme interaction modèle dans une voie de signalisation cellulaire, nous avons choisi l’interaction entre Ras et Raf, qui est l’étape initiale de la voie MAPK conservée qui est hyper-activée dans de nombreux cancers humains5,6,7. Nous avons utilisé le domaine de liaison à Ras de cRaf (cRafRBD) et une version de HRas contenant une mutation en un point, Q61L, qui le rend constitutivement actif6,8,9,10,11,12. L’imagerie de cellules vivantes de cellules HeLa co-exprimant ces deux protéines a montré un niveau élevé de co-localisation (Fig. 1a et Fig. S2 supplémentaire). Nous avons pu diriger cette co-localisation avec la translocation de HRas vers la membrane plasmique déclenchée par la rapamycine13, ce qui a entraîné la localisation simultanée de cRafRBD aux mêmes endroits. La co-IP conventionnelle a également produit une bande western claire, indiquant une interaction protéine-protéine sélective entre HRas constitutivement active et cRafRBD (Fig. 1b, gauche). Cependant, nous avons découvert que cette bande protéique apparemment claire ne contenait que moins de 5 % de l’ensemble des protéines de la proie, ce qui suggère que les protéines de la proie ne sont peut-être pas liées de manière stable aux appâts mais qu’elles ont été éliminées dans la partie de l’écoulement par les processus de lavage (Fig. 1b, droite et Fig. S3 supplémentaire). Nous notons en outre que les deux approches d’imagerie de cellules vivantes et de co-IP ne peuvent pas disséquer la cinétique réelle de cette interaction protéine-protéine peut-être faible et transitoire.

(a) Étude de co-localisation de cellules vivantes pour l’interaction HRas-cRafRBD. Les interactions protéine-protéine entre HRas et cRafRBD ont été évaluées en observant la translocation de cRafRBD vers la membrane plasmique en même temps que HRas. CA et DN désignent les formes constitutivement actives et négatives dominantes de HRas, respectivement. Barre d’échelle, 10 μm. (b) Données de co-IP conventionnelles pour l’interaction HRas-cRafRBD. Pour les analyses de co-IP, les protéines GST-cRafRBD (gauche) et mCherry-HRas (droite) ont été utilisées, respectivement, comme appâts immobilisés sur des billes. (c) Schéma de la co-IP monomoléculaire en temps réel. (d) Image TIRF de mCherry-HRas immobilisée sur la surface. Barre d’échelle, 10 μm. (e) Images successives de l’imagerie en temps réel de la co-IP monomoléculaire. La trace en temps réel de ces événements de liaison est représentée en f et marquée par un carré rouge. Barre d’échelle, 1 μm. (f,g) Traces exemplaires en temps réel provenant de l’imagerie en temps réel de la co-IP à molécule unique. Le signal consiste principalement en une fluorescence de fond diffuse superposée à une séquence de pointes de fluorescence. (h) Expérience de contrôle négatif avec DN HRas (S17N) immobilisée en surface. (i) Distribution kbind pour l’expérience en f. Les taux cinétiques pertinents ont été déterminés à l’aide d’un ajustement à une courbe exponentielle unique (lignes solides). (j) Deuxième expérience de contrôle négatif avec FLAG-eGFP immobilisée en surface. (k) Distribution de kdiss pour l’expérience de f. et de kblinking pour l’expérience de j. Les taux cinétiques pertinents ont été déterminés en utilisant un ajustement de courbe exponentielle unique (lignes solides). Les barres d’erreur indiquent l’erreur standard (s.e. ; n>200).

Pour visualiser l’interaction HRas-cRafRBD en temps réel au niveau de la molécule unique, nous avons fusionné le gène HRas avec la protéine fluorescente rouge mCherry et nous avons fusionné cRafRBD avec la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP ; Fig. 1c). Nous avons exprimé chaque protéine dans un groupe distinct de cellules HEK293. Nous avons utilisé la stratégie de pull-down à molécule unique pour immobiliser mCherry-HRas sur la surface2,3 (Fig. 1c). Nous avons ensuite injecté le second lysat de cellules entières contenant eGFP-cRafRBD sur la surface immobilisée mCherry-HRas comme dans une co-IP conventionnelle (Fig. 1c). Nous avons utilisé un microscope à réflexion interne totale (TIR) pour générer un champ électrique évanescent qui excite sélectivement les eGFP-cRafRBDs qui se trouvent à moins de 100 nm de la surface. Pour observer les faibles interactions protéine-protéine, les arrivées uniques d’eGFP-cRafRBD à la surface ont été suivies en temps réel avec le second lysat de cellules entières maintenu dans la chambre (Fig. 1c).

La figure 1f montre une trace typique en temps réel de cette préparation de co-IP à molécule unique. Chaque trace a été produite en intégrant le signal de fluorescence sur une région d’intérêt (ROI) circulaire d’une superficie de 1,1 μm2 (Fig. 1e). Nous avons contrôlé la densité de surface de mCherry-HRas pour maintenir une moyenne de 0,5 molécule de HRas par ROI (figure supplémentaire S4). Nous avons également utilisé un filtrage gaussien pendant l’intégration du signal et un seuil strict pour la détection du signal afin de garantir que les traces en temps réel signalent les événements de liaison de protéines HRas uniques (figure 1g et figure supplémentaire S5). Chaque trace en temps réel se compose clairement de deux parties : une fluorescence de fond et des pics de fluorescence individuels. Chaque molécule eGFP-cRafRBD, se déplaçant selon un mouvement brownien, devrait passer moins de 50 μs par visite de la couche d’excitation TIR. Comme 50 μs est trois ordres de grandeur plus court que la résolution temporelle de notre appareil d’imagerie (50 ms), le mouvement brownien de nombreuses molécules eGFP-cRafRBD produit un niveau constant pour la fluorescence de fond. Les pics de fluorescence individuels, en revanche, indiquent qu’une seule eGFP-cRafRBD a interagi avec une molécule sur la surface suffisamment longtemps pour survivre à l’intégration du signal de 50 ms.

Nous avons ensuite analysé la cinétique essentielle de cette interaction protéine-protéine en analysant τoff, le temps entre les événements de liaison, et τon, la durée d’un événement de liaison unique (figure 1g). L’ajustement d’équations exponentielles simples aux distributions de τoff et τon donne les taux cinétiques de kbind et kdiss, respectivement. Pour s’assurer que les pics de fluorescence sont bien le résultat d’une interaction spécifique HRas-cRafRBD, nous avons réalisé la même expérience de liaison eGFP-cRafRBD avec une HRas négative dominante (S17N) immobilisée en surface, qui a une affinité réduite pour le GTP14,15. Avec la forme négative dominante, la fréquence des pics de fluorescence (kbind) était sérieusement diminuée (Fig. 1h). Ce contrôle négatif prouve que les pics de fluorescence ne sont ni des artefacts de la simple adsorption de surface de la eGFP-cRafRBD, ni dus à l’immobilisation en surface d’autres protéines avec des interactions eGFP-cRafRBD parasites. Au contraire, ces traces de pointes de fluorescence rendent fidèlement compte des événements de liaison HRas-cRafRBD.

Il est également remarquable que la durée d’un événement de liaison unique ne dure généralement que quelques centaines de ms (Fig. 1f). Nous avons étudié la dynamique du clignotement de FLAG-eGFP16 immobilisé sur une surface avec un anticorps anti-FLAG (Fig. 1j). Le photoblanchiment de la FLAG-eGFP se produit en moyenne toutes les quelques secondes, ce qui donne un taux cinétique inférieur à 0,3 s-1, et ce taux de photoblanchiment de la eGFP est d’un ordre de grandeur plus lent que le kdiss que nous avons mesuré (Fig. 1k). De plus, nous avons revalidé tous les taux cinétiques monomoléculaires de kbind et kdiss en utilisant un critère de co-localisation qui exige la co-localisation des signaux de fluorescence des protéines mCherry-HRas et eGFP-cRafRBD (figure supplémentaire S6). Ainsi, l’interaction HRas-cRafRBD doit effectivement avoir un renouvellement rapide, quelques fois par seconde11,12.

Visualisation des complexes de rencontre dans l’interaction Ras-Raf

L’analyse détaillée de la fréquence de liaison HRas-cRafRBD (kbind) indique l’existence de complexes de rencontre rapides de pré-équilibrage17,18,19,20,21, qui sont des intermédiaires d’interaction protéine-protéine lâches qui doivent être peuplés avant la formation du complexe final HRas-cRafRBD (Fig. 2). Lorsque nous avons augmenté la concentration de eGFP-cRafRBD de 5 à 50 nM, la kbind a montré une augmentation parabolique (Fig. 2a), qui peut être mieux ajustée à l’équation de avec un coefficient de Hill (n) de 1,1 (22,23), une constante de dissociation (K1) de 43 nM pour la formation du complexe de rencontre, et une κon de 2.16 s-1 nM-1, qui est la vitesse cinétique de formation de l’état lié final à partir d’un complexe de rencontre (Méthodes supplémentaires et Fig. S7 supplémentaire). kdiss, d’autre part, est largement constant pour les concentrations eGFP-cRafRBD que nous avons étudiées (Fig. 2b). Ces taux cinétiques mesurés avec notre co-IP monomoléculaire en temps réel sont étroitement cohérents avec les rapports précédents utilisant des essais biochimiques en vrac (tableau supplémentaire S1). Il convient de noter que nous avons supposé une conformation prédominante pour le complexe final HRas-cRafRBD. Bien que notre hypothèse soit corroborée par les distributions unimodales de l’intensité du pic de fluorescence (figure supplémentaire S8), nous ne pouvons pas complètement exclure la possibilité qu’il existe de multiples conformations pour le complexe HRas-cRafRBD avec de multiples voies y menant.

(a) kbind en fonction de la concentration de cRafRBD. Une augmentation linéaire de kbind est représentée à titre de comparaison. (b) kdiss en fonction de la concentration de cRafRBD. kblinking de l’expérience de la figure 1j est montré comme une comparaison. Les barres d’erreur indiquent l’e.s. (n>180). (c-e) Traces en temps réel de l’interaction HRas-cRafRBD. Notez que la fluorescence de fond augmente avec la densité de HRas en surface. Nous avons utilisé la même concentration de proie de =10 nM. (f) Augmentation de la fluorescence de fond en fonction de la densité de HRas en surface. Trois ensembles de données, obtenus avec 10 nM (cercles rouges), 20 nM (triangles verts) de eGFP-cRafRBD et 20 nM de eGFP recombinante (diamants bleus), sont normalisés par le niveau de fluorescence de fond correspondant mesuré à une faible densité de Ras de surface de 0,38 HRas par μm2. Les barres d’erreur indiquent les écarts-type (n>100). (g) Fréquence des pics monomoléculaires en fonction de la fluorescence de fond. L’ensemble de données obtenu avec 10 nM eGFP-cRafRBD est utilisé. Les barres d’erreur indiquent l’e.s. (n>100).

Remarquablement, nous pouvons visualiser les complexes de rencontre en faisant varier la densité de surface de HRas. Si la fluorescence de fond est un simple produit du mouvement brownien de eGFP-cRafRBD, elle dépendrait uniquement de la concentration globale de cRafRBD. Cependant, la fluorescence de fond augmente fortement avec la densité de surface de HRas même si les concentrations de cRafRBD sont maintenues constantes (Fig. 2c-f). À une densité élevée de Ras de 6,4 HRas par μm2, la fluorescence de fond totale devient trois fois plus élevée que celle observée à 0,38 HRas par μm2 (Fig. 2c). Notre simulation numérique montre que la présence de processus de liaison parallèles dans un ROI donné ne peut expliquer que moins de 5 % de l’augmentation observée (figure supplémentaire S9). De plus, lorsque les protéines proies ont été remplacées par des eGFP recombinantes, qui n’interagissent pas avec les protéines HRas immobilisées en surface, leur fluorescence de fond était essentiellement invariable dans la gamme de densités HRas que nous avons étudiée (Fig. 2f, losanges bleus). Ainsi, comme nous avons une population dense de HRas actives à la surface, il semble qu’il y ait effectivement plus de molécules eGFP-cRafRBD qui traînent au-dessus de la surface que ce que l’on pourrait attendre d’une diffusion brownienne pure. Ces complexes de rencontre résultent d’interactions rapides de pré-équilibrage entre les protéines HRas et cRafRBD24, dont la dynamique dépasse notre résolution temporelle.

Nous nous sommes ensuite demandé si les complexes de rencontre servent effectivement de substrats pour le complexe final HRas-cRafRBD. À cette fin, nous avons évalué la fréquence des pics de fluorescence générés par une seule protéine HRas immobilisée en surface. Nous avons raisonné que si les complexes de rencontre sont vrais sur les intermédiaires de la voie pour le complexe final Ras-Raf, la fréquence des pics à une seule molécule devrait croître avec l’augmentation de la fluorescence de fond malgré la même concentration globale de cRafRBD. Pour obtenir la fréquence des pics monomoléculaires dans les environnements denses en HRas, nous avons mesuré le kbind en utilisant un ROI plus petit de 3 par 3 pixels (0,18 μm2) et divisé la valeur de kbind mesurée par le nombre moyen de HRas dans chaque ROI de 3 par 3 pixels (figure supplémentaire S10). Dans l’ensemble, la fréquence des pics monomoléculaires augmentait avec la fluorescence de fond (Fig. 2g, 10 nM eGFP-cRafRBD utilisés). Notre observation suggère que les protéines en aval concentrées sous forme de complexes de rencontre conduisent à la formation du complexe Ras-Raf avec une fréquence accrue.

Analyse par co-IP à une seule molécule des protéines de signalisation dans les cancers

Nous avons jusqu’à présent démontré la mesure en temps réel de la cinétique d’interaction protéine-protéine pendant la co-IP à une seule molécule. Dans ces expériences, cependant, les protéines appât et proie sont fusionnées à des étiquettes de protéines fluorescentes, ce qui pose la question de savoir si nous pouvons étendre cette technique aux protéines natives. À cette fin, nous avons exprimé la protéine HRas mutée (G12V) dans une lignée de cellules épithéliales mammaires humaines non-tumorigènes (MCF10A) pour les transformer en cellules cancéreuses25 (Fig. 3a). Ces cellules transformées, qui ont montré une croissance sans sérum (figure supplémentaire S11), ont formé des tumeurs lorsqu’elles ont été injectées dans le coussinet adipeux mammaire de souris immunodéprimées (figure 3b). Les tissus tumoraux ont été obtenus 17 jours après la xénogreffe, et les tissus témoins ont été préparés à partir des mêmes parties de souris nude non traitées.

(a,b) Transformation de cellules MCF10A en cellules cancéreuses par transduction rétrovirale de HRas (G12V). Cette mutation en un point est connue pour rendre HRas constitutivement actif. L’injection des cellules cancéreuses dans le coussinet mammaire de souris nude entraîne la formation de tumeurs. Barre d’échelle, 5 mm. (c) Schéma de l’analyse par western blot à une seule molécule. La compétition entre le Ras cellulaire et le Ras de la sonde pour la liaison à l’anticorps primaire réduit le nombre de Ras de la sonde spécifiquement liés à la surface, ce qui réduit par conséquent le nombre de points fluorescents. Notez que comme chaque anticorps primaire se lie à deux protéines Ras, un point fluorescent disparaît lorsque les deux bras de la chaîne légère sont occupés par le Ras cellulaire. (d) Mesure prototypique de western blot à une seule molécule. 298 nM de mCherry-HRas ont été utilisés comme protéine cible. Avec 32,5 nM de eGFP-HRas comme sonde, la concentration de la protéine cible a été mesurée à 288±1,4 nM. La barre d’erreur indique la différence entre les deux (n=20). (e) Niveaux d’expression de Ras mesurés tout au long du processus de tumorigenèse de a,b. Les barres d’erreur indiquent la différence entre les deux (n=20). (f) Schéma de l’imagerie co-IP en temps réel pour HRas natif. (g-j) Traces en temps réel de l’imagerie co-IP. Les concentrations de HRas utilisées pour le pull down sont de 3,0 (g), 41,3 (h), 3,5 (i) et 49 nM (j). La fréquence des pics de fluorescence a augmenté de manière significative pour l’extrait de tissu cancéreux lorsque le pull-down de HRas a été augmenté de 1,6 à 22 HRas par μm2 (g versus h). Ceci n’a pas été observé avec l’extrait de tissu témoin (i versus j). (k) Schéma de l’inflation de kbind. Dans des conditions éparses d’appâts actifs sur la surface, un kbind constant et monomoléculaire est obtenu même lorsque l’attraction de surface des appâts est augmentée (deux panneaux de gauche). Cependant, au-delà du seuil de 0,6 appât actif par μm2, plus d’un appât est présent par ROI en moyenne. Ces appâts multiples ont pour effet d’augmenter kbind mesuré à partir de chaque ROI (panneau de droite). (l) kbind en fonction du pull-down HRas. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type (n>180).

Dans un effort pour décrire cette tumorigenèse de manière quantitative, nous avons utilisé des couches tandem d’anticorps ; un anticorps secondaire biotinylé immobilisé en surface et un anticorps primaire spécifique de Ras1,2. Cela a permis de capturer le Ras natif, non marqué, ainsi que le Ras marqué (Fig. 3c). Nous avons d’abord suivi les niveaux d’expression de Ras de manière quantitative tout au long du processus de tumorigenèse. Des extraits de cellules ou de tissus ont été mélangés avec un lysat de cellules HEK293 dilué, qui contenait la sonde Ras (eGFP-HRas) à une concentration connue. Dans les conditions de réaction qui saturent totalement les sites de liaison de l’anticorps primaire, ce mélange entraîne une compétition pour la liaison de l’anticorps spécifique de Ras entre la sonde Ras et le Ras cellulaire cible (Fig. 3c, à gauche). Le nombre de molécules de la sonde Ras liées aux anticorps primaires diminue lorsque la concentration de Ras cellulaire cible augmente. Cette liaison compétitive diminue le nombre de points de fluorescence sur la surface (Fig. 3c, droite), qui suit l’équation de lorsqu’elle est normalisée à une condition de liaison de la sonde Ras uniquement (Fig. S12 supplémentaire). En mesurant le nombre de molécules de sonde liées à plusieurs dilutions différentes, nous avons pu mesurer de manière spécifique et robuste la concentration molaire du Ras cellulaire cible dans les extraits de cellules et de tissus (Fig. 3d et Fig. S12 supplémentaire). Cette analyse western blot à une seule molécule a indiqué des niveaux d’expression de Ras de 42 et 59 nM dans des extraits de 1 mg ml-1 de cellules cancéreuses MCF10A et de tissus tumoraux xénogreffés, respectivement, alors qu’un niveau de base de 7 nM a été mesuré dans des extraits de 1 mg ml-1 de tissu témoin (Fig. 3e).

De plus, nous avons également pu reproduire l’imagerie co-IP à une seule molécule en temps réel des Figs. 1 et 2 sur cette surface native de capture de Ras. Après avoir fixé HRas à partir d’extraits de tumeurs ou de tissus témoins sur la surface d’anticorps tandem, nous avons appliqué un lysat de cellules sondes, un lysat de cellules HEK293 dilué avec 20 nM de protéines proies eGFP-cRafRBD (Fig. 3f). Nous avons analysé les traces de co-IP en temps réel pour déterminer les taux cinétiques kbind et kdiss (Fig. 3g-j). Il est important de noter que les informations sur la concentration provenant de l’analyse de western blot à une seule molécule (Fig. 3e) étaient cruciales pour garantir une concentration spécifique de HRas pour chaque pull down lorsque les extraits de tissus tumoraux et de contrôle avaient des niveaux d’expression de HRas disparates. En utilisant les données d’étalonnage pour le pull down de surface (Fig. S13 supplémentaire), les informations de concentration ont finalement été converties en une densité de surface spécifique des protéines HRas pull-down (Fig. 3g-j).

Nous avons systématiquement étudié le changement de kbind tout en augmentant précisément la densité de surface des protéines HRas pull-down (Fig. 3k). Nous supposons qu’en raison de la régulation cellulaire, seul un sous-ensemble de protéines HRas à la surface devrait être dans l’état chargé en GTP et montrer des événements de liaison actifs avec les protéines proies. Dans une condition clairsemée dans laquelle la distance entre les molécules HRas actives voisines est bien plus grande que le diamètre de chaque ROI, la cinétique observée à partir de chaque ROI devrait être indépendante de l’immobilisation totale des HRas à la surface et rapporter simplement l’activité des protéines HRas uniques (Fig. 3k, deux panneaux de gauche et Fig. S14 supplémentaire). Au fur et à mesure que la surface est encombrée de HRas actives, il devrait y avoir un seuil à partir duquel il commence à y avoir plus d’une molécule de HRas active par ROI. Une fois ce seuil dépassé, les molécules de HRas actives supplémentaires dans chaque ROI produiraient des pics de fluorescence supplémentaires qui gonfleraient par conséquent kbind (Fig. 3k, panneau de droite et Fig. S14 supplémentaire). En effet, nous avons observé une telle tendance biphasique de kbind pour le tissu tumoral, avec un seuil à ~3 HRas tirées vers le bas par μm2 (Fig. 3l).

Ainsi, en dessous du seuil d’inflation de kbind, la cinétique des pics observée refléterait largement l’activité des molécules HRas uniques. Notamment, à 1,6-1,9 HRas tirés vers le bas par μm2, des valeurs de kbind similaires de 0,28 s-1 et 0,22 s-1 ont été observées pour les protéines HRas dérivées de la tumeur et du tissu témoin, respectivement (figure 3l). Les mesures de kdiss étaient également très similaires à 2,5 s-1 (figure supplémentaire S15). La HRas oncogène unique dérivée de la tumeur avait donc une constante de dissociation apparente de 180 nM, ce qui était très similaire à la constante de dissociation de 230 nM pour la HRas active provenant de l’extrait de tissu témoin. Nos observations indiquent un fait crucial : l’activité monomoléculaire du HRas oncogène n’est pas dramatiquement différente de celle d’un HRas de type sauvage activé.

Alors, qu’est-ce qui distingue cet état cancéreux de l’état normal ? Le seuil d’inflation de kbind nous permet de quantifier une autre statistique importante des protéines de signalisation cellulaire, la proportion de protéines HRas se liant activement avec cRafRBD. Intuitivement, le seuil d’inflation des liaisons devrait correspondre à une densité de surface spécifique de protéines appâts « actives ». Dans notre schéma d’imagerie, ce seuil s’est avéré être à 0,6 appâts actifs par μm2, ce qui ne dépend pas des types détaillés de protéines appâts et proies (figure supplémentaire S13). Le seuil de gonflement des kbind ayant été observé à un total de 3 HRas arrachés par μm2, la fraction de HRas actifs a été directement estimée à environ 20% pour le tissu tumoral. En revanche, nous n’avons pas pu observer d’inflation de kbind lorsque même 25 protéines HRas étaient arrachées par μm2 du tissu témoin (figure 3l). Ces observations indiquent que le HRas oncogène dérivé du tissu tumoral présente une fraction active supérieure d’un ordre de grandeur à celle du HRas dérivé du tissu témoin.

Nous nous sommes finalement demandé si cette proportion plus élevée de Ras actif pouvait être une simple conséquence de la surexpression du HRas dans la tumeur xénogreffée. Les protéines HRas surexprimées pourraient être plus nombreuses que les partenaires de liaison putatifs, laissés disponibles pour se lier à Raf marqué à l’eGFP. Pour répondre directement à cette question, nous avons testé deux lignées cellulaires de cancer du sein humain, MCF-7 qui présente un KRas de type sauvage et MDA-MB-231 qui présente une forme mutante de KRas (G13D ; Fig. 4). En particulier, les cellules MDA-MB-231 sont connues pour présenter une dépendance à l’oncogène du gène KRas muté et dépendent de manière critique de la signalisation aberrante de KRas pour leur survie26,27. En utilisant ces deux lignées cellulaires, nous sommes également en mesure de déterminer si nos méthodes s’appliquent à la signalisation KRas, qui a une importance centrale dans le diagnostic moléculaire et le traitement de nombreux cancers humains28.

(a,b) Analyses par western blot à une seule molécule des niveaux d’expression de KRas. KRas marqué par eGFP a été utilisé comme sonde Ras. Le niveau d’expression du KRas de type sauvage dans la lignée MCF-7 a été mesuré à 17,3±1,3 nM, tandis que celui du KRas mutant G13D dans la lignée MDA-MB-231 a été mesuré à 5,5±0,3 nM par 1 mg ml-1 d’extraits. Les barres d’erreur indiquent les s.d. (n=200). (c) kbind en fonction de l’extraction de KRas. Notez la même valeur de kbind partagée par le type sauvage et le mutant KRas dans la région de la cinétique de la molécule unique (la ligne plate commune). Le seuil pour kbind a été mesuré à 1,2 KRas arraché par μm2 pour le KRas mutant de MDA-MB-231, ce qui a donné une fraction active estimée à 50 %. Cette valeur était supérieure d’un ordre de grandeur à 6 % pour le KRas de type sauvage de MCF-7, dont le seuil était de 10 KRas arrachés par μm2. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type (n>150).

Nous avons directement arraché KRas de ces extraits cellulaires en utilisant un anticorps primaire spécifique de KRas. Notre analyse par western blot unimoléculaire a montré que le KRas de type sauvage dans les cellules MCF-7 a une concentration plus élevée (17 nM) que le KRas mutant dans les cellules MDA-MB-231 (5,5 nM dans des extraits de 1 mg ml-1 ; Fig. 4a et Fig. S16 supplémentaire). Compte tenu de l’addiction des cellules MDA-MB-231 à l’oncogène KRas, leur plus faible niveau d’expression de KRas était une observation plutôt inattendue. De plus, la cinétique de signalisation à une seule molécule pour le type sauvage et le mutant KRas est essentiellement la même (Fig. 4c, la ligne plate commune ; voir la Fig. S15 pour kdiss). D’autre part, notre co-IP monomoléculaire en temps réel montre que le seuil d’inflation de la liaison kb pour le mutant KRas de MDA-MB-231 est identifié à 1,2 KRas arraché par μm2, alors que le seuil est observé à ~10 KRas arrachés par μm2 pour le KRas de type sauvage de MCF-7 (Fig. 4c). Comme l’inflation du kbind se produit toujours à 0,6 appâts actifs par μm2, ces seuils disparates indiquent directement que la fraction active du KRas mutant qui se lie fortement à sa cible en aval (15 nM de cRafRBD) est de 50 %, soit près d’un ordre de grandeur supérieur aux 6 % présentés par le KRas de type sauvage. Ainsi, la fraction active plus élevée présentée par le mutant oncogène Ras n’est clairement pas un artefact de surexpression, car le mutant KRas a été exprimé à des niveaux inférieurs, mais a montré une fraction active plus élevée que le type sauvage.