Abstract
La glycogène phosphorylase est une enzyme importante pour le métabolisme des glucides dans le muscle. Elle utilise le phosphate inorganique pour éliminer le glucose du glycogène, produisant du glucose-1-phosphate, qui peut être utilisé pour la production d’ATP. La glycogène phosphorylase inactive (phosphorylase h) est activée soit par la liaison allostérique de 5′-AMP, soit par phosphorylation par la phosphorylase kinase (PhK). La phosphorylation produit la phosphorylase a, qui est active en l’absence d’AMP. La PhK est la seule kinase qui peut phosphoryler la phosphorylase b, qui à son tour est le seul substrat de la PhK. Cette recherche de thèse a tenté de déterminer les raisons de cette spécificité et comment ces deux enzymes se reconnaissent l’une l’autre, en étudiant des mutants dirigés vers un site de la glycogène phosphorylase ; Tous les mutants ont été testés pour des changements dans leur interaction avec une forme tronquée de la sous-unité catalytique de la phosphorylase kinase, gamma(1–300). Trois mutations (R69K, R69E, et E501A), réalisées sur des sites qui interagissent avec l’extrémité amino-terminale de la phosphorylase b ou a, ont montré peu de différence dans la phosphorylation par la gamma(1–300) par rapport à la phosphorylase b. Cinq mutations, réalisées sur trois sites dans la queue amino-terminale de la phosphorylase (K11A, K11E, I13G, R16A, et R16E), ont cependant produit des diminutions de l’efficacité catalytique pour la gamma(1–300), par rapport à la phosphorylase b. R16E était le substrat le plus pauvre pour la gamma(1–300), donnant une diminution de 47 fois de l’efficacité catalytique. L’amino-terminal, et surtout l’Arg 16, sont des facteurs très importants pour la reconnaissance de la phosphorylase par la gamma(1–300). De plus, I13G et R16A ont pu être phosphorylés par la protéine kinase A, qui ne reconnaît pas la phosphorylase native;On a également observé que certains des mutants avaient des états conformationnels modifiés. R16A et R16E ont été activés à une très faible concentration d’AMP et ont cristallisé à basse température, comme la phosphorylase a. Cela indique que même sans phosphorylation, leurs structures ressemblent davantage à la phosphorylase a qu’à la phosphorylase b. Deux autres mutants ont produit l’effet inverse, se comportant comme la phosphorylase b après phosphorylation. R69E n’était que partiellement activé par la phosphorylation, et I13G était complètement inactif après la phosphorylation. I13G a été la première observation d’une forme de phosphorylase qui ne pouvait pas être activée par phosphorylation.