Mécanismes de résistance aux fluoroquinolones et aux carbapénèmes chez Pseudomonas putida

Abstract

Objectifs : Pseudomonas putida est un pathogène opportuniste peu commun, généralement sensible aux agents antimicrobiens. Les données concernant la résistance aux agents antimicrobiens dans les isolats cliniques de P. putida sont limitées.

Patients et méthodes : Les sensibilités aux fluoroquinolones, aux carbapénèmes et à d’autres antibiotiques ont été caractérisées dans cinq isolats cliniques de P. putida récupérés chez différents patients souffrant d’infections des voies urinaires comme agents pathogènes responsables. La résistance aux fluoroquinolones et aux carbapénèmes a été caractérisée génétiquement par les méthodes de PCR et de séquençage de l’ADN. Les profils des protéines de la membrane externe (OMP) ont été caractérisés par SDS-PAGE.

Résultats : Quatre des cinq isolats étaient résistants ou intermédiaires à la fois aux fluoroquinolones et aux carbapénèmes. Les séquences nucléotidiques dans les régions déterminant la résistance aux quinolones suggéraient que des mutations d’acides aminés telles que Thr-83→Ile dans GyrA et Glu-469→Asp dans GyrB pouvaient contribuer à la résistance élevée aux fluoroquinolones. Quatre isolats producteurs de métallo-β-lactamase qui ont montré une résistance aux carbapénèmes portaient les gènes de métallo-β-lactamase de type IMP. Un effet combiné de la production réduite d’OMP de 46 kDa et de la production de métallo-β-lactamase a été montré par un isolat de P. putida présentant les CMI les plus élevées des carbapénèmes.

Conclusions : Cette étude a permis d’identifier les mécanismes de résistance aux fluoroquinolones et aux carbapénèmes dans les isolats cliniques de P. putida.

Introduction

Pseudomonas putida, un bacille Gram négatif non fermentant, est un pathogène humain opportuniste responsable de bactériémies et de septicémies chez les patients néonatals, neutropéniques et cancéreux, ainsi que d’infections urinaires (IU).1-4 Bien que peu fréquent, P. putida peut être une cause d’infections nosocomiales chez des hôtes compromis3.

La plupart des P. putida sont sensibles aux agents antimicrobiens tels que les carbapénèmes, les fluoroquinolones et les aminoglycosides.5-7 Cependant, des isolats cliniques de P. putida qui produisent des métallo-β-lactamases conférant une résistance aux β-lactamines, y compris les carbapénèmes, ont été signalés.3,4,8,9. En outre, des isolats produisant des métallo-β-lactamases qui présentaient une résistance à la ciprofloxacine, à la gentamicine et à la tobramycine en plus des β-lactamines ont été récemment signalés.3 L’émergence de P. putida multirésistants est devenue une cause de difficulté dans le traitement des infections et présente un risque de transmission nosocomiale.

Dans quelques études antérieures, la résistance aux antibiotiques chez P. putida a été caractérisée en ce qui concerne la production de métallo-β-lactamases et les caractéristiques des systèmes d’efflux.3,4,8-12 Selon des rapports provenant d’Europe, de Corée et du Japon, les P. putida résistants aux carbapénèmes produisent fréquemment des métallo-β-lactamases de type IMP et VIM.3,4,8,9,9a Les systèmes d’efflux tels que TtgABC, MepABC, TtgDEF et ArpABC peuvent également contribuer à la résistance multiple aux médicaments chez P. putida.10-12Pseudomonas aeruginosa a la capacité de devenir rapidement résistant au cours du traitement,13 bien que l’on ne sache pas si P. putida a le même potentiel. Pour évaluer les risques d’émergence d’une résistance aux antibiotiques, il est nécessaire de disposer de données abondantes concernant la résistance aux agents antimicrobiens dans les isolats cliniques de P. putida. Dans cette étude, nous avons déterminé les sensibilités aux agents antimicrobiens, y compris les fluoroquinolones et les carbapénèmes, et caractérisé les mécanismes de résistance aux fluoroquinolones et aux carbapénèmes, dans les isolats cliniques de P. putida récupérés comme agents pathogènes causant des infections urinaires pendant une période de 1 an dans notre hôpital.

Patients et méthodes

Patients

Cinq patients (quatre hommes et une femme) diagnostiqués avec des infections urinaires aiguës, répétées ou chroniques causées par P. putida à l’hôpital universitaire de Hamamatsu ont été inclus dans notre étude d’octobre 2001 à septembre 2002.

Souches bactériennes et méthodes microbiologiques

Les souches utilisées dans cette étude étaient cinq isolats cliniques de P. putida récupérés chez différents patients en tant qu’agents pathogènes responsables. L’identification a été effectuée par des tests biochimiques standard dans notre laboratoire de microbiologie clinique. Tous les isolats ont été obtenus à partir d’urine. Les motifs des fragments restreints par SpeI de l’ADN chromosomique de ces cinq isolats variaient (Figure 1). Les bactéries ont été conservées à -70°C dans un bouillon pour perfusion cardiaque (Nissui Pharmaceutical, Tokyo, Japon) contenant 20 % de glycérol. Par la suite, les bactéries ont été inoculées sur des plaques de gélose pour infusion cardiaque (Nissui Pharmaceutical) et incubées à 37 °C pendant la nuit. Les CMI ont été déterminées par une méthode de dilution en gélose telle que décrite par le Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), anciennement le National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS).14 Les tests de sensibilité ont été effectués en utilisant la gélose Mueller-Hinton (Nippon Becton Dickinson, Tokyo, Japon) conformément aux instructions du fabricant. Les critères d’interprétation des CMI de la ceftazidime, de l’imipénème, du méropénème, de la norfloxacine, de la lévofloxacine, de la gatifloxacine, de la gentamicine, de l’amikacine et de la minocycline ont suivi ceux du CLSI/NCCLS.14 Les points de rupture des CMI des autres agents antimicrobiens n’ont pas été définis.

Agents antimicrobiens

Amplification et séquençage de l’ADN des régions déterminant la résistance aux quinolones

L’ADN chromosomique a été extrait des isolats de P. putida comme décrit précédemment.15 L’amplification par PCR a été réalisée avec des ensembles d’amorces spécifiques. Un ensemble d’amorces de 5′-gacggcctgaagccggtgcac-3′ et 5′-gcccacggcgataccgctgga-3′ a amplifié un fragment de 417 pb des régions déterminant la résistance aux quinolones (QRDR) du gène gyrA des positions 115 à 531.16 Un ensemble d’amorces de 5′-agtacttcgccgacttcct-3′ et 5′-tacaggcgcgacaggcgctt-3′ a amplifié un fragment de 739 pb des QRDR du gène gyrB des positions 1073 à 1811.17 Un ensemble d’amorces de 5′-tctacgccatgagcgaactgg-3′ et 5′-agcagcacctcggaatagcg-3′ a amplifié un fragment de 262 pb des QRDR du gène parC des positions 158 à 419.18 Les amplifications ont été effectuées avec l’enzyme Advantage-GC2 (BD Biosciences Clontech Japan, Tokyo, Japon) selon les instructions du fabricant. Les QRDR ont été séquencés à l’aide d’un kit de réaction prêt à l’emploi BigDye terminator v3.0 Taq cycle sequencing avec AmpliTaq DNA polymerase (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) et d’un système de séquençage automatique de l’ADN (analyseur génétique ABI PRISM 310, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Détection génétique des gènes de métallo-β-lactamase

Préparation des protéines de la membrane externe

Les protéines de la membrane externe (OMP) ont été préparées comme décrit précédemment21. Les échantillons ont été analysés par SDS-PAGE.

Résultats

Susceptibilité

Les résultats des tests de sensibilité aux fluoroquinolones et aux carbapénèmes sont résumés dans les tableaux 1 et 2, respectivement. Les CMI des β-lactamines étaient comprises entre >128 mg/L pour l’ampicilline et la céfaloridine, 2 à >128 mg/L pour la ceftazidime, 1 à 128 mg/L pour l’imipénem, 0,5 à >128 mg/L pour le panipénem, 4 à >128 mg/L pour le méropénème et 1 à >128 mg/L pour le biapénème. Les plages de CMI des aminoglycosides et de la minocycline étaient les suivantes : 0,25 à 8 mg/L pour la gentamicine, 0,5 à 8 mg/L pour l’amikacine, 0,5 à 1 mg/L pour la kanamycine et 4 à 64 mg/L pour la minocycline. Quatre isolats étaient résistants ou intermédiaires à la fois aux fluoroquinolones et aux carbapénèmes, tandis qu’un isolat, HU2001-429, était sensible à la fois aux β-lactames et aux fluoroquinolones. Trois isolats de P. putida, HU2001-412, HU2001-419 et HU2001-451, ont présenté une résistance à toutes les β-lactamines examinées telles que la ceftazidime, l’imipénème et le méropénème. Trois isolats, HU2001-412, HU2001-419 et HU2002-467, ont présenté une résistance élevée aux fluoroquinolones (>128 mg/L), dont la norfloxacine, la lévofloxacine, la sparfloxacine, la gatifloxacine et la pazufloxacine, ainsi qu’une résistance à la minocycline (32 à 64 mg/L). Chez les cinq isolats, la plage de CMI de la sitafloxacine était comprise entre ≤0,125 et 8 mg/L.

Résistance aux fluoroquinolones

Résistance aux carbapénèmes

Sur cinq isolats de P. putida, quatre présentant une résistance aux carbapénèmes portaient le gène de la métallo-β-lactamase de type IMP, tandis que les gènes de la métallo-β-lactamase de type VIM n’ont pas été détectés par PCR (tableau 2). Les plages de CMI des carbapénèmes chez P. putida portant les gènes de la métallo-β-lactamase de type IMP étaient les suivantes : 8 à 128 mg/L pour l’imipénème, 32 à >128 mg/L pour le panipénème, 128 mg/L ou plus pour le méropénème et 32 à >128 mg/L pour le biapénème. Chez P. putida HU2001-451, qui a présenté les CMI de carbapénèmes les plus élevées parmi les cinq isolats, la production d’OMP 46 kDa était indétectable par SDS-PAGE, alors que celles de P. putida HU2001-412, HU2001-419, HU2001-429 et HU2002-467 ont été détectées de manière similaire (Tableau 2).

Discussion

Dans cette étude, nous avons caractérisé les sensibilités aux fluoroquinolones et aux carbapénèmes dans cinq isolats cliniques de P. putida isolés de différents patients présentant des infections urinaires aiguës, répétées ou chroniques. Les cinq isolats présentaient des génotypes PFGE différents, ce qui suggère qu’aucune des infections causées par ces P. putida n’était nosocomiale. Quatre des cinq isolats étaient résistants ou intermédiaires à la fois aux fluoroquinolones et aux carbapénèmes. Trois isolats ont montré une résistance élevée (>128 mg/L) à toutes les fluoroquinolones examinées, sauf à la sitafloxacine. Parmi les fluoroquinolones examinées dans cette étude, la sitafloxacine a montré une puissance supérieure contre les isolats de P. putida. Ces isolats hautement résistants aux fluoroquinolones étaient également résistants aux carbapénèmes et à la minocycline. Tous les isolats étaient sensibles aux aminoglycosides comme l’amikacine.

Les études sur la résistance aux fluoroquinolones chez P. putida sont limitées.6,12 Chez P. aeruginosa, les principaux mécanismes responsables de la résistance aux fluoroquinolones comprennent des mutations d’acides aminés dans l’ADN gyrase ou la topoisomérase IV causées par des mutations dans les QRDR de GyrA et ParC, tandis que certains rapports ont suggéré l’implication de mutations de GyrB dans la résistance aux fluoroquinolones.18,22 Un mécanisme de résistance secondaire chez P. aeruginosa qui implique des systèmes d’efflux contribue à une sensibilité réduite aux fluoroquinolones.22,23 Dans cette étude, les altérations des acides aminés dans les QRDR de GyrA, GyrB et ParC ont été comparées entre cinq isolats cliniques de P. putida. Les P. putida résistants aux fluoroquinolones présentaient des mutations supplémentaires telles que Thr-83→Ile dans GyrA et Glu-469→Asp dans GyrB, qui correspondaient aux mutations trouvées dans les P. aeruginosa résistants aux fluoroquinolones.22,23 Ces résultats indiquent que les mutations d’acides aminés dans les QRDR telles que Thr-83→Ile dans GyrA et Glu-469→Asp dans GyrB peuvent contribuer à la résistance élevée aux fluoroquinolones, bien que l’on n’ait pas déterminé si la transformation par des plasmides portant les gènes gyrA, gyrB ou parC de type sauvage dans de tels isolats abaisserait les CMI des fluoroquinolones.24 La plage de CMI de la sitafloxacine était comprise entre ≤0,125 et 8 mg/L pour les cinq isolats de P. putida. Bien que des rapports antérieurs aient montré que la surexpression des systèmes d’efflux TtgABC, MepABC, TtgDEF et ArpABC peut également contribuer à la résistance multiple aux médicaments chez P. putida,10,11,12 le rôle des systèmes d’efflux n’était pas clair dans cette étude.

La résistance aux carbapénèmes chez P. putida causée par la production de métallo-β-lactamases a été signalée.3,4,8,9,9.a Ces métallo-β-lactamases trouvées chez P. putida comprenaient les types IMP et VIM.3,4,8,9,9a Chez les quatre P. putida résistants aux carbapénèmes, la production de métallo-β-lactamases a été détectée par une méthode de diffusion sur disque (données non présentées). Ces isolats portaient les gènes de métallo-β-lactamase de type IMP, alors que les gènes de métallo-β-lactamase de type VIM n’ont pas été détectés par PCR. La prévalence des P. putida producteurs de métallo-β-lactamase est un problème clinique important, représentant un réservoir de déterminants génétiques de la résistance aux β-lactamines. Chez P. aeruginosa, les autres principaux mécanismes de résistance aux carbapénèmes comprennent l’imperméabilité mutationnelle résultant de la perte de l’OprD – un canal transmembranaire formant une porine, accessible aux carbapénèmes mais pas aux autres β-lactamines – ainsi que la production de métallo-β-lactamases21,25,26 . La perte de l’OprD entraîne une résistance à l’imipénème et une sensibilité réduite au méropénème chez P. aeruginosa.27 Chez P. putida HU2001-451, présentant les CMI les plus élevées (≥128 mg/L) de tous les carbapénèmes parmi quatre isolats résistants aux carbapénèmes, la production d’OMP 46 kDa était réduite par rapport à celles des autres isolats. Les profils d’OMP de P. putida HU2001-451 étaient similaires à ceux de P. aeruginosa résistant aux carbapénèmes, chez qui une production réduite d’OprD a été identifiée dans notre étude précédente21. Ces résultats ont montré un effet combiné de la production réduite de l’OMP 46 kDa coexistant avec la production de métallo-β-lactamases sur la résistance aux carbapénèmes dans l’isolat, bien que la question de savoir si d’autres β-lactamases avaient une pertinence pour la résistance aux carbapénèmes n’était pas claire.

En conclusion, nous avons caractérisé la résistance aux fluoroquinolones et aux carbapénèmes dans les isolats cliniques de P. putida. Nos résultats indiquent que les mutations d’acides aminés dans les QRDR, telles que Thr-83→Ile dans GyrA et Glu-469→Asp dans GyrB, peuvent contribuer à la résistance élevée aux fluoroquinolones chez P. putida. Quatre isolats de P. putida producteurs de métallo-β-lactamase qui ont montré une résistance aux carbapénèmes portaient le gène de la métallo-β-lactamase de type IMP. Nous avons trouvé un effet combiné de la production réduite d’OMP de 46 kDa et de la production de métallo-β-lactamases qui a renforcé la résistance aux carbapénèmes dans un isolat de P. putida présentant les CMI les plus élevées des carbapénèmes.

Nous remercions le laboratoire médical Miroku, Saku, Nagano, Japon, pour l’analyse PFGE. T. H. est soutenu par une subvention d’aide à la recherche scientifique (17790353) du ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports, de la Science et de la Technologie du Japon.

Notes des auteurs

1Département de médecine de laboratoire, École de médecine de l’Université de Hamamatsu, 1-20-1 Handa-yama, Hamamatsu 431-3192, Japon ; 2Groupe de recherche sur le contrôle des infections, École de médecine de l’Université de Hamamatsu, 1-20-1 Handa-yama, Hamamatsu 431-3192, Japon ; 3Division of Pharmacy, Hamamatsu University School of Medicine, 1-20-1 Handa-yama, Hamamatsu 431-3192, Japon ; 4Département de médecine de laboratoire clinique, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 54 Shogoin-Kawahara-cho, Sakyo-ku, Kyoto 606-8507, Japon

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