Marquage 18O : un outil pour la protéomique

Une évaluation du marquage protéolytique et de la quantification des protéines à des fins de diagnostic en utilisant la trypsine et le H2O enrichi en 18O est présentée. Nous démontrons que la quantification comparative ou relative peut être réalisée efficacement avec cette approche. Nous avons développé un protocole qui permet la conservation des peptides marqués dans l’eau d’abondance naturelle sans crainte de rétro-échange, à condition que le pH soit suffisamment bas pour éteindre l’activité catalytique de la trypsine, mais pas au point de favoriser un rétro-échange chimique. Comme l’efficacité du marquage dépend de la nature du peptide, il n’existe pas de relation linéaire simple entre la teneur relative du mélange tampon de digestion 16O/18O (x) et l’efficacité du marquage (y), mais plutôt une relation basée sur la probabilité y = x(2). Ainsi, l’étendue du marquage des peptides en utilisant des ratios de mélange tampon de digestion 16O/18O peut dévier de manière significative de ce qui est attendu sur la base d’une relation linéaire. L’évaluation de l’efficacité relative de Ziptip a indiqué une perte de récupération de l’échantillon au fur et à mesure que la concentration de peptide était réduite dans des conditions normales, ce qui suggère qu’il existe une limite en dessous de laquelle les rendements diminuent. En outre, les pertes adsorptives dues au séchage et à la récupération par Speedvac ont indiqué des pertes modestes (20 %) qui peuvent varier considérablement (0-50 %) d’un peptide à l’autre. L’efficacité de la digestion en solution des mélanges de protéines standard en fonction de la concentration a révélé une diminution linéaire avec une concentration décroissante. Ceci est cohérent avec les effets cinétiques des enzymes et souligne une erreur de quantification potentielle qui pourrait survenir lors de l’évaluation de l’expression différentielle basée sur la détection des peptides. Les résultats de nos études démontrent la puissance du marquage 18O comme outil d’optimisation pour le développement de processus protéomiques.