Population étudiée
Cette enquête est basée sur les cohortes HAPIEE (Health, Alcohol and Psychosocial factors in Eastern Europe) de Pologne, de République tchèque et de Lituanie , et sur le suivi de 8 ans de la cohorte allemande ESTHER (nom allemand : « Epidemiologische Studie zu Chancen der Verhütung, Früherkennung und optimierten Therapie chronischer Erkrankungen in der älteren Bevölkerung ») .
L’ensemble de l’étude HAPIEE comprend des cohortes dans quatre pays. Comme il n’a pas été possible d’exporter des échantillons de sang de Russie, seules trois cohortes ont été incluses dans l’analyse actuelle. Les participants à l’étude ont été recrutés dans six villes tchèques (Havirov/Karvina, Hradec Kralove, Jihlava, Kromeriz, Liberec et Usti nad Labem) en 2002-2005 (n = 8 857), à Cracovie, en Pologne, en 2002-2005 (n = 10 728) et à Kaunas, en Lituanie, en 2006-2008 (n = 7 161). Chaque cohorte est constituée d’un échantillon aléatoire d’hommes et de femmes, âgés de 45 à 75 ans au départ, stratifié par sexe et par groupes d’âge de 5 ans, sélectionné à partir des registres de population. Le taux de réponse global était de 61 %. Les données ont été recueillies par questionnaire et par un court examen dans une clinique au cours duquel un échantillon de sang veineux à jeun a été prélevé.
L’étude ESTHER est une cohorte basée sur la population de 9 949 adultes, âgés de 50 à 74 ans au départ, recrutés par leur médecin généraliste (GP) lors d’un examen de santé de routine entre 2000 et 2002 dans le Land allemand de la Sarre . L’enquête actuelle est basée sur le suivi de huit ans, effectué entre juillet 2008 et décembre 2010, au cours duquel les participants à l’étude avaient entre 56 et 85 ans. Entre le début de l’étude et le suivi après 8 ans, 499 personnes sont décédées, 505 n’étaient plus en mesure de participer en raison d’un mauvais état de santé et 680 ont refusé de participer à nouveau. Parmi les 8 265 participants restants, 6 061 ont renvoyé un questionnaire (taux de réponse, 73,4 %) et 4 637 ont donné un échantillon de sang dans le cabinet de leur médecin généraliste. Les médecins généralistes des participants à l’étude ont également rempli un questionnaire sur l’état de santé des participants (disponible pour n = 5 997). En outre, 3 124 participants à l’étude ont consenti à une évaluation gériatrique supplémentaire de 3 heures réalisée par les médecins de l’étude au domicile des participants.
Les variables des études ESTHER et HAPIEE ont été harmonisées et les marqueurs du stress oxydatif ont été mesurés dans le cadre du Consortium sur la santé et le vieillissement : Network of Cohorts in Europe and the United States (CHANCES ; www.chancesfp7.eu), qui a été décrit ailleurs . Les études sont menées conformément à la déclaration d’Helsinki et le consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants à l’étude.
Éthique, consentement et autorisations
Les études incluses ont été approuvées par les comités d’éthique locaux respectifs (ESTHER : Faculté de médecine de l’Université de Heidelberg et Association médicale de la Sarre ; HAPIEE : University College London (Grande-Bretagne), Institut national de santé publique (Prague, République tchèque), Université Jagiellonian (Cracovie, Pologne) et Université lituanienne des sciences de la santé (Kaunas, Lituanie)). Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants inclus dans les études analysées et les études sont menées conformément à la Déclaration d’Helsinki.
Évaluation des covariables
Dans les études ESTHER et HAPIEE, les données sociodémographiques, le mode de vie et les antécédents de maladie ont été évalués par des questionnaires auto-administrés. La taille et le poids ont été mesurés et complétés par des informations autodéclarées dans ESTHER pour les participants à l’étude qui n’ont pas consenti à la visite à domicile. En plus des informations autodéclarées, les antécédents de maladies chroniques courantes ont été validés dans l’étude ESTHER en consultant les dossiers médicaux ou le registre du cancer de la Sarre. L’insuffisance rénale était définie par un débit de filtration glomérulaire estimé <60 ml/min/1,73 m2, calculé avec l’équation de la Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration basée sur la créatinine . Dans la cohorte ESTHER, les concentrations de créatinine sérique ont été évaluées par une méthode cinétique de Jaffé sur un Cobas 8000 C701 (analyte : CREJ2 3000, Roche). Le cholestérol total et le cholestérol à lipoprotéines de haute densité (HDL) ont été évalués dans des échantillons de sérum par chromatographie enzymatique (analytes : Chol2 2100, HDLC3 450, Roche) et la protéine C-réactive (CRP) par immunoturbidimétrie sur le Cobas 8000 C701 (analyte : CRPL3 500, Roche). Dans l’étude HAPIEE, le cholestérol total et le cholestérol HDL ont également été évalués avec la même méthodologie de dosage et les mêmes analytes Roche, mais des auto-analyseurs différents ont été utilisés (HAPIEE République tchèque et Lituanie : Roche Cobas Mira ; HAPIEE Pologne : Hitachi 917/Modular P). En outre, dans toutes les cohortes HAPIEE, la créatinine et la CRP sériques ont été évaluées avec la même méthodologie de dosage que dans ESTHER, mais avec des analytes provenant d’un fournisseur différent (Beckman-Coulter) et sur un autoanalyseur différent (LX-20 Pro, Beckman-Coulter).
Constitution de la mortalité
Pour ces analyses, nous avons utilisé le suivi de la mortalité totale par les registres officiels de mortalité nationaux (République tchèque, Allemagne), locaux (Lituanie) ou régionaux (Pologne) jusqu’au 31 décembre 2010 en Pologne, au 31 décembre 2011 en République tchèque et en Lituanie, et jusqu’au 31 juillet 2014 en Allemagne. En Allemagne, la mortalité par cause n’était disponible que pour les décès survenus jusqu’au 2 avril 2013. Les registres étaient complets pour tous les participants qui n’ont pas déménagé en dehors de la région couverte par le registre. La perte de suivi due à la migration était de 4 % dans les cohortes HAPIEE (combinées) et de 2 % dans l’étude ESTHER. Tous les décès codés avec les codes CIM-10 I00-I99 ont été considérés comme des décès cardiovasculaires et les décès par cancer ont été définis par les codes CIM-10 C00-C97.
Mesure des marqueurs sériques du stress oxydatif
Les dosages utilisés pour mesurer les niveaux de d-ROMs (Diacron, Grosseto, Italie) et de TTL (Rel Assay Diagnostics, Gaziantep, Turquie) ont été adaptés à un autoanalyseur (LX20-Pro, Beckman-Coulter, Woerden, Pays-Bas) au Laboratoire de recherche sur la protection de la santé (Bilthoven, Pays-Bas), comme décrit précédemment . Le test d-ROMs mesure la concentration d’hydroperoxyde en unités Carratelli (Carr U), du nom de l’inventeur du test, Mauro Carratelli. Chaque unité Carr correspond à 0,08 mg de peroxyde d’hydrogène (H2O2)/100 ml dans l’échantillon. Le dosage du TTL mesure la concentration de groupes thiol libres dans l’échantillon en μmol/L.
Les mesures ont été effectuées sur des échantillons de sérum qui avaient été conservés pendant environ 3 à 10 ans dans des congélateurs à -80 °C. Les d-ROM et le TTL ont une bonne stabilité à long terme dans ces conditions . Dans le cadre du suivi de 8 ans de l’étude ESTHER, la d-ROM et le TTL ont été mesurés chez tous les participants qui ont donné des échantillons de sang au cabinet de leur médecin généraliste (n = 4 637). Cependant, les mesures ont été effectuées à deux moments différents car le financement n’était pas disponible pour mesurer tous les échantillons dans l’étude pilote menée en juin 2012 . Pour corriger les décalages potentiels dans les dosages, 80 échantillons du point temporel 1 (juin 2012) ont été mesurés à nouveau au point temporel 2 (septembre 2014) et des équations de régression linéaire ont été obtenues et utilisées pour normaliser les résultats du point temporel 2 aux niveaux du point temporel 1, lorsque les mesures dans les cohortes HAPIEE ont également eu lieu (tout au long de l’année 2012). La concordance des mesures de d-ROM était élevée (coefficient de corrélation de Spearman r = 0,92 et différence de moyennes = 15 Carr U) et aucune correction n’a donc été appliquée. Pour le TTL, un décalage évident des résultats du dosage (r = 0,88 et différence de moyennes = 81 μmol/L) a été corrigé en appliquant l’équation suivante à toutes les mesures du point temporel 2 : TTLtime-point2 = 0,746 × TTLtime-point1. En outre, nous avons exclu 610 mesures dans des échantillons de sang qui ne remplissaient pas les critères stricts de qualité hémolytique, ictérique et lipémique de l’étude ESTHER, ce qui laisse 4 027 mesures à analyser dans la présente étude. Dans les cohortes HAPIEE, le nombre d’échantillons qui ne remplissaient pas ces critères de qualité était négligeable.
Échantillon de l’étude analytique
En raison d’un financement limité, les niveaux de d-ROMs et de TTL n’ont pas été mesurés chez tous les participants des cohortes HAPIEE ; au lieu de cela, un plan de contrôle de cas appariés a été adopté (fichier supplémentaire 1 : figure S1). Les cas ont été définis comme étant tous les sujets décédés au cours du suivi (n = 1 433) ou ayant subi un infarctus du myocarde (IM) ou un accident vasculaire cérébral (AVC) non fatal (n = 658). Les témoins (n = 4 396) ont été appariés en fréquence aux cas par sexe et par groupes d’âge de 5 ans. Afin de corriger le suréchantillonnage pour les infarctus du myocarde et les accidents vasculaires cérébraux dans cette analyse de la mortalité, les sujets ayant subi un infarctus du myocarde ou un accident vasculaire cérébral non fatal au cours du suivi ont été exclus des cas dans un premier temps. Afin d’ajouter aux témoins un échantillon représentatif de sujets ayant subi un infarctus ou un accident vasculaire cérébral non fatal, on a calculé, dans un deuxième temps, la proportion observée d’infarctus ou d’accidents vasculaires cérébraux non fatals dans chaque strate d’âge et de sexe de la cohorte totale. Dans une troisième étape, ces proportions ont été multipliées par la taille des échantillons de chaque strate chez les témoins dont les marqueurs de stress oxydatif ont été mesurés. Dans une quatrième étape, les nombres résultants ont été sélectionnés de façon aléatoire dans chaque strate à partir du groupe de sujets ayant subi un infarctus ou un accident vasculaire cérébral non fatal et ajoutés aux témoins, ce qui a permis d’obtenir un groupe de 4 552 témoins éligibles pour les 1 433 décès. Dans la dernière étape, le pool de témoins éligibles a été utilisé pour apparier individuellement exactement deux témoins à chaque décès par cohorte, sexe et âge (±5 ans).
Analyses statistiques
Les différences dans les caractéristiques de base entre les cas (décès pendant le suivi) et les témoins ont été évaluées avec le test χ2 pour les variables catégorielles et le test de Wilcoxon rank-sum pour les variables continues. Les associations transversales des facteurs de risque établis de mortalité avec des niveaux élevés de stress oxydatif ont été évaluées à l’aide de modèles de régression logistique comprenant toutes les caractéristiques de base modélisées comme des variables catégorielles (tableau 1). La variable dépendante » stress oxydatif élevé » a fait l’objet de deux définitions différentes basées sur les niveaux de d-ROMs ou de TTL. Pour les d-ROM, conformément aux instructions du fabricant, un seuil clinique de >400 Carr U a été utilisé, ce qui a permis de classer 23 % de la cohorte ESTHER et 30 % des témoins éligibles de la cohorte HAPIEE dans la catégorie de stress oxydatif » élevé « . Pour le TTL, aucun seuil clinique n’est disponible et, comme le test n’est pas encore normalisé, les moyennes de population varient fortement entre les cohortes. Par conséquent, pour faire correspondre la proportion d’individus présentant un stress oxydatif élevé obtenue par la définition basée sur les niveaux de d-ROMs, le quartile inférieur du TTL spécifique à la cohorte (25 %) a été utilisé pour classer les sujets dans une catégorie de stress oxydatif élevé basée sur le TTL. Les analyses transversales ont été réalisées chez tous les sujets et séparément chez les femmes et les hommes.
Pour les analyses longitudinales, La régression des risques proportionnels de Cox (cohorte ESTHER) et la régression logistique conditionnelle (étude cas-témoins appariée HAPIEE) ont été utilisées pour estimer les rapports de risque et les rapports de cotes, respectivement, pour une augmentation des niveaux de d-ROMs et une diminution du TTL d’un écart-type (ET) spécifique à la cohorte. En outre, les niveaux de d-ROMs ont également été modélisés comme une variable catégorielle, avec les seuils cliniques recommandés par le fabricant pour un stress oxydatif modéré (341-400 Carr U), élevé (401-500 Carr U) et très élevé (>500 Carr U) par rapport aux sujets dont le stress oxydatif n’est pas augmenté ou est faible (≤340 Carr U). Lorsque le risque absolu est faible, les régressions logistique et de Cox donnent généralement des résultats similaires et l’odds ratio peut être considéré comme une approximation du hazard ratio, plus précis. Nous avons utilisé le terme risque relatif (RR) pour les deux estimations de l’effet. Dans le cadre d’une analyse de sensibilité, des analyses sur la mortalité par cause dans la cohorte ESTHER ont été effectuées en tenant compte du risque concurrent de décès dû à d’autres causes en ajustant un modèle de régression des risques de sous-distribution proportionnelle avec des pondérations pour les sujets qui ont subi l’événement à risque concurrent selon une extension de la méthode de Fine et Gray . Cependant, les résultats étaient presque identiques à ceux de la régression traditionnelle des risques proportionnels de Cox et, par conséquent, seuls ces derniers résultats sont présentés dans ce manuscrit.
Les analyses ont été menées séparément pour chaque cohorte et regroupées par méta-analyse avec pondération Mantel-Haenszel et effets aléatoires , en tenant compte de la taille de l’échantillon des cohortes et de la possibilité d’hétérogénéité statistique entre les études. Cette dernière a été examinée à l’aide du test Q de Cochrane et de la statistique I2.
Les résultats suivants ont été analysés : mortalité toutes causes confondues, MCV, cancer et non MCV, causes non cancéreuses. Pour chaque résultat, quatre modèles statistiques ont été développés, avec une inclusion croissante des facteurs de risque de mortalité établis dans les modèles. Les niveaux de d-ROM et de TTL ont toujours été inclus dans le même modèle car leur corrélation était faible (r <0,08 dans chaque cohorte). Dans le modèle 1, un ajustement a été effectué pour l’âge et le sexe dans la cohorte ESTHER, alors que cela n’a pas été nécessaire pour les cohortes HAPIEE car les cas ont été appariés individuellement à deux témoins par âge et sexe et analysés dans une analyse stratifiée dans laquelle les strates sont constituées de la collection d’ensembles appariés. Le modèle 2 a en outre ajusté l’éducation, l’indice de masse corporelle (IMC), le tabagisme, la consommation d’alcool et l’activité physique. Le modèle 3 incluait également les maladies qui pourraient potentiellement médier l’association entre le stress oxydatif et la mortalité (c’est-à-dire la dyslipidémie (évaluée par le cholestérol total et le cholestérol HDL), l’insuffisance rénale, les antécédents de diabète, l’hypertension, l’infarctus, l’accident vasculaire cérébral et le cancer). Enfin, le modèle 4 a été ajusté en plus pour les niveaux de CRP, qui étaient fortement corrélés aux niveaux de d-ROM (r = 0,34-0,41 dans les cohortes) et, moins fortement, au TTL (r = 0,11-0,17 dans les cohortes). L’âge a été modélisé comme une variable continue et toutes les autres variables ont été modélisées comme des variables catégorielles (les catégories sont indiquées dans le tableau 1). Nous avons testé les interactions entre les d-ROMs/TTL et les covariables en ajoutant les termes d’interaction appropriés au modèle 2.
Les sous-groupes à analyser ont été choisis a priori dans le but de stratifier pour les déterminants potentiels les plus importants des niveaux élevés de stress oxydatif : cohorte/pays, âge, sexe, antécédents d’IM ou de cancer et statut inflammatoire. En raison de la taille limitée de l’échantillon, les analyses stratifiées ont été restreintes à la mortalité toutes causes confondues, aux MCV et au cancer. Pour tenir compte de la possibilité d’un biais de causalité inverse, les analyses ont été menées séparément pour les événements survenus au cours des années 1-2, 3-4 et 5-6 du suivi. En raison de la taille limitée de l’échantillon, cette analyse stratifiée n’a pu être réalisée que pour la mortalité toutes causes confondues. Pour éviter l’instabilité du modèle, le résultat d’une analyse de sous-groupe spécifique à une cohorte n’a été pris en compte pour la méta-analyse que si au moins 25 événements sont survenus dans le sous-groupe.
L’imputation multiple a été employée pour imputer le nombre de valeurs de covariables de base manquantes indiquées dans le fichier supplémentaire 1 : tableau S1. La proportion de valeurs manquantes était inférieure à 5 % pour toutes les variables, à l’exception de la consommation d’alcool et de l’activité physique, qui présentaient jusqu’à 22 % de valeurs manquantes. À notre connaissance, les données étaient manquantes au hasard, ce qui est l’hypothèse de l’imputation multiple. Séparément par cohorte, statut de cas et sexe, 20 ensembles complets de données ont été imputés avec la procédure SAS 9.3 « PROC MI », en utilisant la méthode de Monte Carlo par chaîne de Markov. Les variables du modèle « complet » ont été utilisées pour le modèle d’imputation. Toutes les analyses multivariables ont été réalisées dans les 20 ensembles de données imputées et les résultats des ensembles de données individuels ont été combinés par la procédure SAS 9.3 « PROC MIANALYZE ».
Les méta-analyses ont été réalisées avec le logiciel statistique Comprehensive Meta-Analysis 2.0 (Biostat, Englewood, NJ, USA). Toutes les autres analyses ont été effectuées avec SAS, version 9.2 (Cary, Caroline du Nord, États-Unis). Tous les tests statistiques étaient bilatéraux, en utilisant un niveau alpha de 0,05.