Les thiols réagissent avec ce composé en clivant le lien disulfure pour donner du 2-nitro-5-thiobenzoate (TNB-), qui s’ionise en dianion TNB2- dans l’eau à pH neutre et alcalin. Cet ion TNB2- a une couleur jaune.
Cette réaction est rapide et stœchiométrique, l’addition d’une mole de thiol libérant une mole de TNB. Le TNB2- est quantifié dans un spectrophotomètre en mesurant l’absorbance de la lumière visible à 412 nm, en utilisant un coefficient d’extinction de 14 150 M-1 cm-1 pour les solutions tampons diluées, et un coefficient de 13 700 M-1 cm-1 pour les concentrations élevées en sels, comme le chlorhydrate de guanidinium 6 M ou l’urée 8 M. Malheureusement, le coefficient d’extinction pour les solutions diluées a été sous-estimé dans la publication originale de 1959, à 13 600 M-1 cm-1, et comme le souligne un article récent, cette erreur a persisté dans la littérature. Le DTNB commercial peut ne pas être complètement pur, et peut donc nécessiter une recristallisation pour obtenir des résultats complètement précis et reproductibles.
Le réactif d’Ellman peut être utilisé pour mesurer les thiols de faible masse moléculaire, comme le glutathion, à la fois dans des solutions pures et dans des échantillons biologiques, comme le sang. Il peut également mesurer le nombre de groupes thiol sur les protéines.