Réponses cellulaires et moléculaires à un traitement aigu à la cocaïne dans les cellules N2a de type neuronal : mécanisme potentiel de sa résistance dans la mort cellulaire

Matériaux

Culture cellulaire

Les cellules N2a (CCL-131, ATCC) ont été maintenues en culture monocouche48, et a été largement employée pour des études sur les substances d’abus14,49,50 ou les troubles du SNC comme les maladies de Parkinson51 ou d’Alzheimer47,52,53. L’un des avantages de cette lignée cellulaire est que les changements morphologiques fins dus à une exposition chimique peuvent être facilement détectés en raison de la taille plus importante des cellules. Sauf indication contraire, toutes les expériences de notre étude ont été réalisées dans un milieu RPMI-1640 sans rouge de phénol, contenant 10 % de FBS. Les cellules ensemencées dans des plaques de culture ou des plats ont pu croître pendant 4 à 5 jours dans l’incubateur pour la différenciation spontanée des excroissances de neurites. Toutes les études ont été répétées au moins deux fois.

Morphologie

Pour les évaluations morphologiques cellulaires grossières, les cellules37 colorées au cristal violet ont été photomicrographiées à l’aide des systèmes d’imagerie cellulaire EVOS avec un objectif ×40. Dans certaines études, la morphologie ou les vacuoles des cellules colorées au cristal violet ont été prises à l’aide d’un microscope inversé à contraste de phase IX-70 Olympus. Les excroissances de neurites ont été quantifiées à l’aide du logiciel image J (National Institutes of Health).

Electrophysiologie

Un patch clamp à cellule entière a été utilisé pour enregistrer à partir de cellules N2a cultivées sur des lamelles couvre-objet en plastique. Les lamelles ont été lavées trois fois avec une solution d’enregistrement extracellulaire contenant (en mM) 145 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 10 glucose et 10 HEPES (312 mOsm, pH 7,4) et ont été incubées dans cette solution à température ambiante. Les lamelles couvre-objet ont été soit laissées non traitées, soit traitées avec 6,25 μM ou 4 mM de cocaïne directement dans la solution extracellulaire pendant l’enregistrement. Les électrodes en verre (résistance 1-5 MΩ) ont été remplies d’une solution intracellulaire contenant (en mM) 130 KCl, 2 NaCl, 10 HEPES et 5 EGTA (292 mOsm, pH 7,4). Les cellules ont été visualisées sous contraste de phase avec un microscope inversé Nikon Eclipse Ti-U et une caméra numérique monochrome DS-Qi1 attachée.

Les enregistrements ont été effectués avec un amplificateur Axopatch 200B (Molecular Devices, CA) et numérisés avec un système Digidata 1440A (Molecular Devices, CA). Les courants ioniques ont été enregistrés selon un protocole de clampage de tension (-60 à 135 mV par pas de 15 mV, durée 250 ms). Les courants postsynaptiques spontanés ont été enregistrés sous une tension continue de -80 mV pendant 2 minutes. Un protocole de clampage de courant (-100 à 200 pA par paliers de 20 pA, durée 800 ms) a été utilisé pour évaluer la capacité des cellules N2a à émettre des potentiels d’action en réponse à l’injection de courant. Les signaux ont été filtrés à 1 kHz et échantillonnés à 10 kHz. Les données ont été recueillies et analysées à l’aide du logiciel pCLAMP 10 (Molecular Devices, CA).

Traitements

Une quantité connue de chlorhydrate de cocaïne a été dissoute dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sous forme de stock 1 M juste avant les essais. Afin de simuler les concentrations pharmacologiques in vivo de cocaïne, allant de 1 nM à 6,25 μM, plusieurs stocks de travail (0,04, 0,2, 0,4, 1, 2, 4, 8, 20, 40, 200 et 400 μM) ont été préparés dans du PBS ; de même, pour des concentrations de cocaïne plus élevées (2, 3 et 4 mM finaux), des stocks de travail de 80, 120 et160 mM ont été préparés dans du PBS. À partir de chaque stock de travail, 5 μl de cocaïne a été ajouté par puits pour atteindre les concentrations souhaitées ainsi que pour prévenir les altérations du pH dans le milieu de culture37. Le volume final dans chaque puits était de 200 μl. Alors que la sélection de concentrations plus faibles était basée sur les rapports de cocaïne nano à micro molaire inférieure dans les cellules du SNC de toxicomanes13, les concentrations plus élevées étaient basées sur plusieurs études in vitro14,15,16. Des cellules avec du milieu seul ou un volume égal de véhicule (PBS) dans le milieu ont servi de témoins, tandis que le milieu dépourvu de cellules a été pris comme blanc. Sur la base de nos études précédentes sur les cellules C6 de type astrogliales6, les traitements à la cocaïne dans la présente étude ont également été effectués pendant 1 h à des fins de comparaison. Par ailleurs, l’effet de la cocaïne chez les toxicomanes s’estompe au cours de cette période pour des quantités et des voies d’absorption typiques33. Dans un sous-ensemble d’expériences, les cellules dans des plaques à 96 puits ont été prétraitées avec 1 µM YM155, un inhibiteur du gène de la survivine, pendant 30 min, suivi d’un co-traitement à la cocaïne (2-4 mM) pendant 1 h et évalué pour la viabilité cellulaire, tandis que dans d’autres études, les cellules ont été prétraitées avec 5 μM PIK-75, un inhibiteur de Nrf-224, pendant 30 min avant le co-traitement à la cocaïne (2-4 mM) pendant 1 h et évalué pour la viabilité cellulaire et les niveaux de GSH.

Viabilité et vacuolisation

La viabilité cellulaire a été évaluée par la prise de teinture de cristal violet comme décrit précédemment54,55. L’étendue de la vacuolisation des cellules a été quantifiée dans les cellules fixées au glutaraldéhyde par absorption de colorant rouge neutre comme décrit précédemment56. Le colorant a été extrait avec de l’éthanol à 70 % et de l’acide chlorhydrique à 0,37 %, et l’absorbance à 540 nm a été mesurée dans un lecteur de plaques. Les cellules colorées au cristal violet ont été utilisées pour la photomicrographie des vacuoles à l’aide d’un microscope inversé à contraste de phase IX-70 Olympus avec un objectif ×40.

Vidéomicroscopie

Pour la vidéographie en direct, une des lentilles oculaires du microscope inversé à contraste de phase IX-70 Olympus a été remplacée par un système de caméra vidéo oculaire standard. La sortie du connecteur vidéo a été reliée à un ordinateur pour la visualisation des images sur le moniteur à l’aide du programme logiciel Electronic Ocular -R-AMCap, fourni par Zhejiang JinCheng Scientific & Technology Co., Ltd, (HangZhou, Chine). La documentation vidéo a été prise à une vitesse de 14 images par seconde.

Dossier d’intégrité de la membrane cellulaire

L’intégrité de la membrane cellulaire a été déterminée en mesurant la libération de LDH cytoplasmique avec le kit de dosage CytoTox 96 non radioactif (Promega, Madison, WI) selon les instructions fournies par le fabricant. En bref, les cellules dans des plaques de microtitration à 96 puits ont été traitées avec différentes concentrations de cocaïne (2, 3 et 4 mM) pendant 1 h. Puis 50 μl de milieu de test ont été transférés dans une nouvelle plaque à 96 puits, mélangés avec un volume égal de mélange de substrat du kit, et incubés pendant 30 min à 37 °C. L’absorbance a été prise dans un lecteur de plaque à 490 nm.

Mesure des ROS intracellulaires

Les cellules dans les plaques 96 puits ont été traitées avec de la cocaïne à 2, 3 et 4 mM pendant 1 h, suivie d’une coloration avec un colorant perméable aux cellules H2DCFDA (10 μM final) pendant 30 min6. Après un lavage doux et un séchage à l’air des cellules, du PBS (100 μl/puits) a été ajouté. Les plaques ont été lues avec le filtre d’excitation réglé à 485 nm et le filtre d’émission à 530 nm dans un lecteur automatique (BioTek™ Synergy HTX multimode micro plate reader, BioTek Instruments, Winooski, VT).

Dossier de peroxydation lipidique

Les cellules ont été ensemencées à une densité de départ de 0,3 × 106 cellules par puits dans des plaques à six puits. La peroxydation lipidique a été mesurée comme décrit précédemment57. En bref, après un traitement à la cocaïne à 2, 3 et 4 mM pendant 1 h, les cellules ont été récoltées et centrifugées à 13 000 rpm sur une micro centrifugeuse de table pendant 6 min. Tous les culots cellulaires ont été soniqués dans du PBS sur glace pendant 3 s et transférés dans des tubes en verre. Puis les lysats ont été mélangés avec 30% d’acide trichloracétique, 0,37% d’acide thiobarbiturique (TBA). Le mélange a été bouilli pendant 10 min, refroidi à la température ambiante (RT), transféré dans de nouveaux tubes de Falcon et centrifugé à 3038 × g pendant 10 min. Le surnageant clair a été transféré dans une plaque à 96 puits et l’absorbance à 535 nm a été mesurée dans un lecteur de microplaques. Le milieu clair sans cellules a été utilisé comme blanc.

Activité métabolique mitochondriale générale et potentiel membranaire

Des cellules (2 × 104) ont été traitées avec différentes concentrations de cocaïne (2, 3 et 4 mM) pendant 1 h dans des plaques de microtitration à 96 puits. Puis les plaques ont été centrifugées à 304 × g pendant 4 min, et le milieu contenant la cocaïne a été jeté soigneusement. Après avoir ajouté immédiatement du milieu frais aux cellules (200 μl), 10 μl de MTS (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-5(3-carboxyméthonyphénol)-2-(4-sulfophényl)-2H-tétrazolium, Promega) ont été ajoutés par puits comme indiqué précédemment58 et incubés pendant 30 min à 37 °C. L’absorbance a été mesurée dans un lecteur de microplaques à 490 nm. Le potentiel membranaire a été évalué selon la procédure antérieure46. À la fin du traitement de 1 h avec la cocaïne, les cellules monocouches ont été recouvertes de 100 μl de glutaraldéhyde aqueux à 0,25 % pour la fixation, contenant du Rh 123 pour obtenir une concentration finale de 2,6 μM pendant 30 min à RT. Le surnageant a été jeté, et les plaques ont été lavées à l’eau et séchées à l’air libre sous la hotte. Enfin, 100 μl de Triton×100 à 0,1 % dans du PBS ont été ajoutés par puits et incubés à 37 °C pendant 1 h. Les plaques ont été lues avec le filtre d’excitation réglé à 485 nm et le filtre d’émission à 538 nm sur un lecteur de microplaques multimode BioTek™ Synergy™ HTX.

Détection du lactate

Les études menées sur des cellules cultivées dans un milieu contenant 10% de FBS ont donné des valeurs de fond élevées en raison de l’interaction du sérum avec certains des composants du kit (Trinity Biotech, Jamestown, NY). Ainsi, dans nos études ultérieures, avant les traitements, le milieu contenant 10% de FBS a été remplacé par du sérum réduit (0,1% de FBS) dans des plaques de microtitration à 96 puits (2 × 104 cellules par puits). Le réactif du kit a été dissous dans une solution chromogène composée de 5,3 mM d’acide vanillique, 2,9 mM de 4-amino antipyrine et environ 4 unités de peroxydase de raifort. Au terme de 1 h de traitement à la cocaïne, le réactif du kit a été ajouté directement dans les puits (20 μl par 200 μl) et les plaques ont été maintenues dans l’incubateur à 37 °C pour le développement de la couleur (5-10 min). L’absorbance des cellules non traitées a été prise comme contrôle, tandis que le milieu dépourvu de cellules a été pris comme blanc. L’absorbance a été mesurée à 490 nm dans un lecteur de microplaques.

Spectroscopie RMN

La libération de lactate par les cellules a été détectée par spectroscopie RMN du proton (1H+). La quantité de sérum n’interférant pas dans cette méthode, nous avons utilisé 10% de FBS dans le milieu dans des plaques de microtitration à 96 puits (2 × 104 cellules/200 μl par puits). À la fin de 1 h de traitement à la cocaïne, le milieu (0,15 ml par puits) de toutes les répliques (n = 12) de chaque traitement a été regroupé (1,8 ml) dans les tubes étiquetés. Le milieu des cellules non traitées a été utilisé comme contrôle. Comme les échantillons traités contenaient 2-4 mM de cocaïne, nous avons ajouté de la cocaïne (4 mM final) au milieu témoin. Les analyses RMN ont été réalisées sur Bruker Avance 800 (\(\nu _0\) = 800,23 MHz) qui est équipé d’une cryosonde TCI 800S6 H-C/N-D-05 Z (l’intensité maximale du gradient de champ z est de 48 G/cm). Pour obtenir un spectre RMN unidimensionnel (1D), 16 transitoires ont été acquis et coadditionnés avec un délai d’acquisition de 3 s. Des points de données (32 000) ont été obtenus. Des points de données (32 000) ont été utilisés pour obtenir une largeur spectrale de 7500 Hz. Le pic d’eau dominant positionné à 4,75 ppm dans le spectre a été éliminé en utilisant la séquence d’impulsions WATERGATE W520. Une largeur de bande de 3000 Hz de chaque côté du pic d’eau a été donnée comme fenêtre spectrale pour observer les pics de soluté en employant un temps de retard de 333,3 μs pour les trains d’impulsions WATERGATE. Un standard externe, une solution aqueuse de DMSO de 3,3 mM, a été préparé pour la quantification du lactate dans la solution d’échantillon.

Mesure de H2S dans le milieu de culture cellulaire

Les cellules ont été ensemencées à une densité de départ de 2 × 104 par puits dans des plaques à 96 puits. Avant le traitement à la cocaïne, de l’acétate de zinc aqueux à 1,64 %59,60 (final : 0,041 %) a été ajouté aux cellules pour convertir le gaz H2S volatil en sulfure de zinc pendant le traitement à la cocaïne. Après 1 h de traitement avec 2, 3 et 4 mM de cocaïne, 17,453 mM de sulfate de N,N-diméthyl-p-phénylènediamine dans 7,2 M HCl (final : 2,55 mM) et 26,18 mM de FeCl3 dans 1,2 M HCl (final : 3,83 mM) ont été ajoutés aux puits et agités doucement. Les bulles dans le milieu ont été éliminées en ajoutant 5 μl d’éthanol froid dans tous les puits juste avant de lire les plaques à 670 nm dans un lecteur de microplaques.

Dosage de bioluminescence de l’ATP

Des cellules dans des plaques de microtitration à 96 puits ont été traitées avec différentes concentrations de cocaïne (2, 3 et 4 mM) pendant 1 h. L’ATP total a été mesuré à l’aide du kit de dosage des cellules somatiques à l’ATP bioluminescent (FLASC, Sigma-Aldrich) selon les instructions du kit fournies par le fabricant. En bref, à la fin du traitement, 75 μl de solution de libération de l’ATP des cellules somatiques ont été ajoutés par puits pour lyser les cellules. Puis 50 μl de lysat ont été transférés dans de nouvelles plaques 96 puits blanches à fond transparent, qui contenaient déjà 50 μl d’enzyme ATP assay mix sous lumière réduite. La luminescence a été mesurée immédiatement sur un lecteur de microplaques multimode BioTek™ Synergy™ HTX.

Isolation d’ARN et synthèse d’ADNc

Les cellules ont été ensemencées à une densité de 2 × 106 dans des boîtes de culture de 100 mm de diamètre. Au moment du traitement, les cellules ont atteint environ 65-70% de confluence. Après 1 h de traitement avec 2-4 mM de cocaïne, les cellules ont été récoltées par grattage et centrifugées à 1125 × g pendant 5 min. L’ARN total a été isolé selon le protocole fourni par le fabricant (Qiagen Sciences, German town, MD) en utilisant les mini-colonnes de spin RNeasy. Un traitement à la DNase I (Qiagen Sciences) a été effectué sur la colonne. L’ARN total de la colonne a été élué avec 20 μl d’eau sans RNase. Pour les besoins de la quantification, l’ARN sur la glace a été dilué dans de l’eau sans RNase dans un rapport de 1:10. La quantité d’ARN total a été mesurée par le spectrophotomètre Nanodrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). L’ARN présentait un rapport >1,95 à 260/280 nm, et a ensuite été utilisé pour la synthèse d’ADNc. Un microgramme d’ARN total a été utilisé pour produire de l’ADNc à l’aide d’un kit de synthèse d’ADNc iScript (Bio-Rad, Hercules, CA) conformément aux instructions du fabricant.

Expression relative par RT-PCR quantitative

L’analyse de l’expression génétique de Nrf-2, de la survivine (Birc5) et de la GAPDH par qPCR a été réalisée dans un thermocycleur iCycler avec le système de détection MyiQ (Bio-Rad) en utilisant le supermélange iQ SYBR Green. Les produits de Nrf-2, de survivine et de GAPDH ont été synthétisés par des réactions PCR séparées, réalisées dans un volume final de 20 μl avec 2 μl d’échantillon d’ADNc et 500 nM d’amorces spécifiques. Les conditions de cyclage étaient les suivantes : 95 °C pendant 10 min, suivi de 40 cycles de 95 °C pendant 15 s, 55 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s, tandis que l’analyse de la courbe de fusion après la PCR a été réalisée à 55-95 °C. La quantification relative des expressions génétiques a été réalisée selon la méthode 2-△△CT61 avec la GAPDH comme contrôle endogène. Les séquences d’amorces utilisées pour les analyses sont présentées dans le tableau 1.

Dosage du GSH total

Après avoir traité avec différentes concentrations de cocaïne (2-4 mM) dans un milieu complet pendant 1 h dans des plaques de microtitration à 96 puits, les cellules ont été fixées avec du glutaraldéhyde à 0,25% pendant 30 min, puis lavées doucement trois fois, et séchées à l’air. Le GSH cellulaire total a été dosé comme décrit précédemment62. L’absorbance a été mesurée à 412 nm dans un lecteur de microplaques.

Préparation des lysats de cellules entières

Pour les dosages enzymatiques, les cellules ont été ensemencées à une densité de 2 × 106 dans des boîtes de culture de 100 mm de diamètre. Après 1 h de traitement avec 2-4 mM de cocaïne, les cellules ont été récoltées à l’aide de racleurs de cellules. Après centrifugation à 1 620 × g pendant 5 minutes, les culots cellulaires ont été conservés à -70 °C jusqu’à leur utilisation ultérieure. Le jour des tests, les culots ont été remis en suspension dans 0,5 ml de PBS et soniqués deux fois sur glace pendant 15 s. Le contenu a été transféré dans des tubes eppendorf et microcentrifugé à 5000 rpm pendant 5 min. Les surnageants ont été transférés dans de nouveaux tubes et utilisés pour les essais enzymatiques. La concentration en protéines de chaque lysat a été déterminée à l’aide du kit de dosage des protéines BCA (Pierce, Rockford, IL) selon les instructions du fabricant en prenant l’albumine sérique bovine comme référence standard.

Dosage de la catalase

Elle a été dosée selon la méthode antérieure63. Le mélange réactionnel (450 μl) dans une cuvette en quartz contenait 50 μl de lysat cellulaire (60 μg), 250 μl de tampon phosphate 50 mM (pH 7,0). La réaction a été lancée par l’ajout de 150 μl de 30 mM de H2O2 (10 mM final). La diminution de l’absorbance à 240 nm a été suivie pendant 2 min dans un spectrophotomètre UV-Vis Genesys 10 S (Thermo Scientific, Vernon Hills, IL). L’activité enzymatique a été calculée en utilisant le coefficient d’extinction de 0,00706 par mmol par mm et l’unité d’activité enzymatique a été exprimée en mmol H2O2 décomposé par minute par mg de protéine. Ensuite, l’activité enzymatique des échantillons traités a été comparée au contrôle (100%).

Dosage de la GPx

Elle a été dosée selon la procédure publiée64. Le mélange réactionnel (500 μl) contenait 1 mM de GSH, 0,15 mM de NADPH, 0,12 unité de glutathion réductase (GR), 0,1 mM d’azide de sodium dans du phosphate de potassium 0,1 M (pH 7,0 avec 1 mM d’EDTA. L’azide de sodium a été ajouté au mélange réactionnel pour inhiber l’activité de la catalase endogène. Le mélange réactionnel a été incubé avec 60 μg d’échantillon pendant 10 min sans NADPH, et la réaction a été lancée par l’ajout de NADPH et de H2O2 à une concentration finale de 150 μM. Le taux de consommation du NADPH a été suivi à 340 nm pendant 3 min. Une unité d’activité GPx a été définie comme la quantité d’enzyme nécessaire pour consommer 1 μmol de NADPH/min dans l’essai couplé et l’activité a été exprimée par mg de protéine. Ensuite, l’activité enzymatique des échantillons traités a été comparée au témoin (100%).

Analyse statistique

Les résultats expérimentaux (n = nombre de puits regroupés à partir d’au moins deux expériences différentes) ont été présentés sous forme de moyenne ± SEM. Tous les graphiques à barres ont été tracés à l’aide du logiciel GraphPad Prism, version 3.00 (San Diego, CA). Les données ont été analysées pour leur signification par une ANOVA à sens unique, puis comparées à l’aide des tests de comparaison multiple de Dunnett ou de Bonferroni. Les valeurs de test de P < 0,05 et P < 0,01 ont été considérées comme significatives et hautement significatives, respectivement.