Résolution axiale

1.43.2 Le cas des techniques de microscopie à superrésolution

Les résolutions latérale et axiale dans le microscope optique sont fondamentalement limitées par la diffraction dans la relation entre la longueur d’onde de la lumière et l’ouverture, ou l’angle d’acceptation, de l’objectif utilisé pour l’imagerie, comme décrit par Ernst Abbe en 1873. Dans la dimension latérale, cette limite de résolution est d’environ 200 nm, et dans la dimension axiale, elle est d’environ 500 nm. La limite de diffraction de la microscopie optique provient des limitations fondamentales de l’optique utilisée pour la formation de l’image. Si l’on considère l’image formée par une source de lumière sphérique de sous-résolution, on constate que l’image qui résulte de l’optique du microscope, même parfaitement corrigée et sans aberration, n’est pas décrite par une simple sphère. En fait, on observe une distribution d’intensité 3D complexe au point focal, et cette distribution d’intensité 3D peut être décrite mathématiquement par la fonction d’étalement du point (PSF) (Figure 1). Le maximum central de la PSF contient 86,5 % de l’intensité énergétique totale disponible. Dans les dimensions latérales et axiales, l’intensité énergétique restante est représentée par une série de maxima et de minima à symétrie de rotation. C’est l’interaction des PSF provenant d’éléments d’image adjacents qui détermine finalement la limite de résolution par diffraction du microscope optique.

Figure 1. Cartes d’intensité XY (a) et XZ (b) d’une fonction d’étalement de point idéale.

Lorsque deux objets se rapprochent l’un de l’autre dans l’espace, leurs PSF se chevauchent et bientôt les deux objets ne peuvent plus être discriminés l’un de l’autre. Le chevauchement minimum de deux PSF qui peut être toléré avant une perte de la capacité à les distinguer l’un de l’autre a été décrit comme étant le point auquel l’intensité chute d’environ 25% entre les deux PSF. Le point où cette baisse d’intensité est atteinte est équivalent à la distance entre le maximum central et le premier minimum du PSF. Il est très difficile de déterminer avec précision cette distance car il est difficile de positionner le minimum avec précision, et à la place, on utilise la demi-largeur maximale (FWHM) du maximum central du PSF.

À partir de ces deux équations, nous voyons que les résolutions latérales et axiales dépendent de l’ouverture numérique du système optique collectant la lumière et de la longueur d’onde de la lumière elle-même. L’amélioration du pouvoir de résolution provient de l’utilisation d’objectifs à ouverture numérique élevée et de longueurs d’onde de la lumière plus courtes. D’autres facteurs tels que la luminosité relative des deux objets (contraste) influencent cette distance minimale de résolution. En termes pratiques, dans l’imagerie par microscope, il faut à la fois une ouverture numérique optique et un contraste suffisants pour visualiser avec précision les détails subcellulaires.

L’abaissement de la longueur d’onde d’illumination dans la gamme ultraviolette pour améliorer la résolution limite ses choix de sondes fluorescentes, et repousse les limites des corrections optiques et des propriétés de transmission du chemin optique du microscope. D’autres complications proviennent de l’utilisation de l’éclairage ultraviolet dans les études de cellules vivantes, où de nombreux chercheurs ont noté les effets délétères de ces longueurs d’onde sur la viabilité à long terme des cellules. Les conceptions optiques modernes ont permis d’améliorer les ouvertures numériques des lentilles, bien que la véritable amélioration à cet égard ne soit venue qu’avec l’utilisation de supports de montage exotiques et de matériaux de verre de recouvrement. Ces deux stratégies ne parviennent pas à apporter plus qu’une amélioration modeste de la résolution et sont peu pratiques pour les études sur les cellules vivantes.

La microscopie confocale biologique, qui utilise une ouverture en trou d’épingle pour améliorer le contraste au foyer par l’élimination efficace de la lumière parasite des plans d’objets hors foyer, est devenue un outil d’imagerie standard dans l’étude des relations structure-fonction cellulaires . L’amélioration de la visualisation du plan d’image au foyer permet d’atteindre plus facilement les limites pratiques de résolution par diffraction lorsque l’instrument est réglé de manière critique. Théoriquement, avec des ouvertures de sténopé inférieures à 1 unité d’Airy, les résolutions latérales et axiales s’améliorent effectivement jusqu’à une limite de 1,4 fois celle du cas du microscope à grand champ. Cependant, dans la pratique, les diamètres de trou d’épingle inférieurs à 1 unité Airy fournissent trop peu de lumière pour l’imagerie biologique, car une grande partie de l’émission au foyer est rejetée par le trou d’épingle avec la lumière hors foyer indésirable. Pour l’imagerie biologique, où l’on se bat généralement pour obtenir le signal d’émission, le rejet d’une partie de ce signal limité pour un petit gain de résolution n’est pas pratique. En fait, lorsque le signal d’émission de l’échantillon est limité, on choisit généralement d’ouvrir le sténopé à des diamètres supérieurs à 1 unité d’Airy afin de collecter plus de signal au prix d’une plus grande épaisseur de la tranche optique. A ces diamètres de sténopé, la résolution du microscope confocal est essentiellement la même que celle d’un microscope fluorescent conventionnel à grand champ.

Cela ne veut pas dire que l’on ne peut pas détecter des objets plus petits que la limite de résolution – la détection même au niveau des molécules uniques est possible, et maintenant relativement simple en utilisant les technologies modernes de détection. La suppression totale de l’éclairage direct entrant dans l’objectif en microscopie à fond noir crée un excellent contraste, de sorte que même la petite quantité de lumière diffusée par des objets limités par la diffraction comme les microtubules (25 nm de diamètre) est facilement observable. La microscopie à fluorescence offre également d’excellentes conditions de contraste qui peuvent permettre l’observation et l’enregistrement d’objets dont les dimensions sont bien inférieures à la limite de résolution par diffraction. Avec la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF), le contraste est amélioré par rapport à la microscopie à fluorescence à grand champ standard en limitant l’excitation axiale à quelques centaines de nanomètres de l’interface fluide-verre de recouvrement en utilisant l’énergie lumineuse évanescente en champ proche pour l’excitation du fluorophore. Dans ces conditions, même la mobilité d’une seule molécule peut être suivie dans le temps dans une section optique très fine. Cependant, ni la microscopie en champ sombre ni la microscopie TIRF n’améliorent la résolution du système optique – les deux techniques reposent sur de grandes différences de contraste entre l’objet d’intérêt et le fond pour permettre une détection de sous-résolution.

Pousser au-delà des limites classiques de résolution par diffraction a représenté un grand défi dans la microscopie optique moderne. Les avantages de l’amélioration de notre capacité à résoudre des détails plus fins à partir du microscope optique sont évidents. Une plus grande résolution permettrait une description structurelle plus précise des organisations moléculaires fondamentales pour la physiologie et le comportement cellulaires normaux et anormaux. Les dissections moléculaires et biochimiques ne permettent pas de révéler toute la complexité des organisations fonctionnelles telles que celles que l’on trouve au niveau des contacts focaux d’adhésion. Pouvoir visualiser directement, avec des résolutions proches de la dimension moléculaire, ces organisations fonctionnelles augmenterait considérablement notre compréhension des interrelations moléculaires et des changements d’organisation liés aux états fonctionnels ou physiologiques. Récemment, un certain nombre de chercheurs ont exploité plusieurs stratégies différentes pour améliorer de façon substantielle (de 2 à 10 fois ou plus) les limites classiques de résolution latérale et axiale. Ces techniques se répartissent en deux catégories générales : celles qui reposent sur des changements dans l’illumination de l’échantillon, et celles qui utilisent des stratégies de détection de molécules uniques ainsi que la dimension temporelle pour construire une image superrésolue.

Pour les besoins de cet article, les techniques qui ont conduit au développement et à l’introduction d’instruments commerciaux par plusieurs fabricants ont été choisies. L’utilisation de ce critère spécifique pour sélectionner les méthodes discutées ci-dessous ne doit en aucun cas être interprétée comme une approbation de ces techniques par rapport à d’autres qui ont été introduites dans la littérature. Au fur et à mesure que les travaux se développent dans ce domaine en évolution rapide, il se peut que de nouvelles méthodes et approches remplacent celles décrites ci-dessous. Cependant, l’introduction de ces instruments commerciaux sur le marché permet à un large éventail de biologistes de différentes disciplines d’appliquer les méthodes de superrésolution à leurs propres questions biologiques spécifiques, sortant ainsi ces méthodes des laboratoires de développement spécialisés. Les lecteurs sont encouragés à examiner par eux-mêmes les images de haute qualité contenues dans le matériel supplémentaire en ligne accompagnant de nombreux articles référencés.