Enzymes et composants clésEdit
Le processus de recombinaison V(D)J est médié par la recombinase VDJ, qui est une collection diverse d’enzymes. Les enzymes clés impliquées sont les gènes d’activation de la recombinaison 1 et 2 (RAG), la désoxynucléotidyl transférase terminale (TdT) et la nucléase Artemis, un membre de la voie omniprésente de jonction des extrémités non homologues (NHEJ) pour la réparation de l’ADN. Plusieurs autres enzymes sont connues pour être impliquées dans le processus, notamment la protéine kinase ADN-dépendante (DNA-PK), la protéine XRCC4 (X-ray repair cross-complementing protein 4), l’ADN ligase IV, le facteur 1 de jonction des extrémités non homologues (NHEJ1 ; également connu sous le nom de Cernunnos ou XRCC4-like factor), le paralogue de XRCC4 et XLF (PAXX) récemment découvert, et les ADN polymérases λ et μ. Certaines enzymes impliquées sont spécifiques aux lymphocytes (par exemple, RAG, TdT), tandis que d’autres sont présentes dans d’autres types de cellules et même de manière ubiquitaire (par exemple, les composants NHEJ).
Pour maintenir la spécificité de la recombinaison, la recombinase V(D)J reconnaît et se lie aux séquences signaux de recombinaison (RSS) flanquant les segments de gènes variables (V), de diversité (D) et de jonction (J). Les RSS sont composées de trois éléments : un heptamère de sept nucléotides conservés, une région d’espacement de 12 ou 23 paires de bases de long, et un nonamère de neuf nucléotides conservés. Bien que la majorité des RSS varient dans leur séquence, les séquences consensuelles de l’heptamère et du nonamère sont respectivement CACAGTG et ACAAAAACC ; et bien que la séquence de la région d’espacement soit peu conservée, sa longueur est hautement conservée. La longueur de la région d’espacement correspond à environ un (12 paires de bases) ou deux tours (23 paires de bases) de l’hélice d’ADN. Selon ce que l’on appelle la règle 12/23, les segments de gènes à recombiner sont généralement adjacents à des RSS de longueurs d’espacement différentes (c’est-à-dire que l’un a un « 12RSS » et l’autre un « 23RSS »). C’est une caractéristique importante dans la régulation de la recombinaison V(D)J.
ProcessEdit
La recombinaison V(D)J commence lorsque la recombinase V(D)J (par l’activité de RAG1) se lie à un RSS flanquant un segment de gène codant (V, D ou J) et crée une coupure simple brin dans l’ADN entre la première base du RSS (juste avant l’heptamère) et le segment codant. Cette opération est essentiellement neutre sur le plan énergétique (pas de nécessité d’hydrolyse de l’ATP) et entraîne la formation d’un groupe hydroxyle 3′ libre et d’un groupe phosphate 5′ sur le même brin. Le groupe hydroxyle réactif est positionné par la recombinase pour attaquer la liaison phosphodiester du brin opposé, formant deux extrémités d’ADN : une épingle à cheveux (tige-boucle) sur le segment codant et une extrémité émoussée sur le segment signal. Le modèle actuel est que l’entaillage de l’ADN et la formation de l’épingle à cheveux se produisent sur les deux brins simultanément (ou presque) dans un complexe connu sous le nom de centre de recombinaison.
Les extrémités émoussées du signal sont ligaturées ensemble de façon à former un morceau circulaire d’ADN contenant toutes les séquences intermédiaires entre les segments codants, connu sous le nom de joint de signal (bien que de nature circulaire, il ne faut pas le confondre avec un plasmide). Alors que l’on pensait à l’origine qu’elles étaient perdues au cours des divisions cellulaires successives, il existe des preuves que les jonctions signal peuvent réintégrer le génome et entraîner des pathologies en activant des oncogènes ou en interrompant la ou les fonctions des gènes suppresseurs de tumeurs.
Les extrémités codantes sont traitées davantage avant leur ligature par plusieurs événements qui conduisent finalement à la diversité jonctionnelle. Le traitement commence lorsque DNA-PK se lie à chaque extrémité cassée de l’ADN et recrute plusieurs autres protéines, notamment Artemis, XRCC4, l’ADN ligase IV, Cernunnos et plusieurs ADN polymérases. La DNA-PK forme un complexe qui conduit à son autophosphorylation, entraînant l’activation d’Artemis. Les épingles à cheveux de l’extrémité codante sont ouvertes par l’activité d’Artémis. Si elles sont ouvertes au centre, on obtient une extrémité d’ADN émoussée ; cependant, dans de nombreux cas, l’ouverture est « décentrée » et il reste des bases supplémentaires sur un brin (un surplomb). On parle alors de nucléotides palindromiques (P) en raison de la nature palindromique de la séquence produite lorsque les enzymes de réparation de l’ADN résolvent le surplomb. Le processus d’ouverture de l’épingle à cheveux par Artemis est une étape cruciale de la recombinaison V(D)J et est défectueux dans le modèle murin d’immunodéficience combinée sévère (scid).
Puis, XRCC4, Cernunnos et DNA-PK alignent les extrémités de l’ADN et recrutent la désoxynucléotidyl transférase terminale (TdT), une ADN polymérase indépendante de la matrice qui ajoute des nucléotides non tempérés (N) à l’extrémité codante. L’ajout est essentiellement aléatoire, mais la TdT montre une préférence pour les nucléotides G/C. Comme toutes les ADN polymérases connues, la TdT ajoute des nucléotides à un brin dans une direction 5′ vers 3′.
En dernier lieu, les exonucléases peuvent éliminer les bases des extrémités codantes (y compris les nucléotides P ou N qui ont pu se former). Les ADN polymérases λ et μ insèrent alors des nucléotides supplémentaires si nécessaire pour rendre les deux extrémités compatibles pour la jonction. Il s’agit d’un processus stochastique, donc n’importe quelle combinaison d’ajout de nucléotides P et N et d’élimination exonucléolytique peut se produire (ou aucune). Enfin, les extrémités codantes traitées sont ligaturées ensemble par l’ADN ligase IV.
Tous ces événements de traitement aboutissent à un paratope qui est très variable, même lorsque les mêmes segments de gènes sont recombinés. La recombinaison V(D)J permet de générer des immunoglobulines et des récepteurs des lymphocytes T à des antigènes que ni l’organisme ni ses ancêtres n’ont besoin d’avoir rencontrés auparavant, ce qui permet une réponse immunitaire adaptative aux nouveaux agents pathogènes qui se développent ou à ceux qui changent fréquemment (par exemple, la grippe saisonnière). Toutefois, ce processus présente un inconvénient majeur : la séquence d’ADN doit rester dans le cadre afin de maintenir la séquence d’acides aminés correcte dans le produit protéique final. Si la séquence résultante est hors-cadre, le développement de la cellule sera arrêté et la cellule ne survivra pas jusqu’à maturité. La recombinaison V(D)J est donc un processus très coûteux qui doit être (et est) strictement réglementé et contrôlé.