RNase A : Questions fréquemment posées | AG Scientific Blog

Introduction à la RNase

Les ribonucléases (RNases) sont un grand groupe d’enzymes hydrolytiques qui dégradent les molécules d’acide ribonucléique (ARN). Ce sont des nucléases qui catalysent la décomposition de l’ARN en composants plus petits. Elles constituent une superfamille d’enzymes qui catalysent la dégradation de l’ARN, opérant aux niveaux de la transcription et de la traduction.

3D conformation de l’enzyme ribonucléase A

Ces enzymes sont présentes dans toutes les cellules vivantes et les fluides biologiques, y compris les procaryotes et les eucaryotes, et remplissent de nombreuses fonctions importantes. Les RNases sont omniprésentes, avec une durée de vie très courte dans un environnement non protégé. Les effets cytotoxiques comprennent le clivage de l’ARN qui entraîne l’inhibition de la synthèse des protéines et l’induction de l’apoptose. Ces effets cytotoxiques peuvent être produits en appliquant la RNase à la surface extérieure de la cellule, mais il a été constaté que la cytotoxicité est multipliée par 1000 lorsque l’enzyme est artificiellement introduite dans le cytosol, ce qui indique que l’internalisation dans la cellule est l’étape limitant le taux de toxicité.

Les RNases sont classées en endoribonucléases et exoribonucléases. Les endoribonucléases sont les formes A, P, H, I, III, T1, T2, U2, V1, PhyM et V.

Les exoribonucléases comprennent les formes RNase PH, II, R, D et T ainsi que la polynucléotide phosphorylase (PNPase), l’oligoribonucléase, l’exoribonucléase I et l’exoribonucléase II. Ces enzymes clivent différemment diverses espèces d’ARN.

Récemment, les chercheurs se sont intéressés aux RNases comme agents possibles pour le traitement du cancer. L’idée est de trouver une enzyme endommageant sélectivement les cellules cancéreuses sans affecter les cellules normales environnantes.

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Foire aux questions sur la RNase A

Qu’est-ce que la RNase A ?

La ribonucléase A est une enzyme digestive sécrétée par le pancréas qui  » digère  » ou hydrolyse spécifiquement les polymères d’ARN (mais pas d’ADN) par clivage endonucléasique des liaisons phosphodiester formant les liens covalents entre les résidus ribonucléotidiques adjacents de ces molécules.

Que signifie « A » dans RNase A ?

Le « A » de son nom ne fait pas référence à sa spécificité de substrat, mais à la forme prédominante de l’enzyme produite par le pancréas bovin. La RNase A n’est pas modifiée, alors que la RNase B, la RNase C et la RNase D sont des mélanges de glycoformes.

En raison de sa disponibilité en grande quantité et de sa grande pureté, la RNase A a fait l’objet de travaux marquants en chimie des protéines et en enzymologie. En outre, des variantes et des homologues cytotoxiques de l’enzyme ont démontré leur utilité en tant qu’agents chimiothérapeutiques.

Quelle est l’histoire de cette enzyme ?

Elle a été utilisée par Christian Anfinsen pour prouver que la séquence des acides aminés, détermine la structure d’une protéine repliée et elle a été utilisée par Stanford Moore et William Stein pour montrer qu’un arrangement spécifique d’acides aminés est utilisé dans le centre catalytique des enzymes.

La ribonucléase A a également été la première enzyme synthétisée par R. Bruce Merrifield, montrant que les molécules biologiques sont simplement des entités chimiques qui peuvent être construites artificiellement. Tous ces concepts centraux, découverts grâce à la ribonucléase, ont été récompensés par des prix Nobel.

Quelle est la structure de la RNase A ?

Structure de la RNase

La séquence relativement petite de 124 acides aminés de la RNase A qui a une masse moléculaire de 12 600 Da. contient quatre résidus His, deux des résidus His12 et His119 sont directement impliqués comme résidus catalytiques de cette enzyme. Le cycle imidazole de His12 a une valeur pK anonymement basse (pK < 6,0) suggérant qu’il doit être déprotoné pour la catalyse. À l’inverse, le cycle imidazole de His119 a une valeur pK anonymement élevée (pK > 6,0) suggérant qu’il doit être protoné pour la catalyse.

La ribonucléase A est-elle une protéine ?

La RNase A est une petite protéine, l’enzyme mature ne possède que 124 résidus d’acides aminés, sans aucun glucide attaché. Contrairement aux autres enzymes, la RNase A contient 19 des 20 acides, ne manquant que le tryptophane.

Quel est le mécanisme d’action ?

His12 agit comme une base générale, acceptant le proton 2′-OH de l’anneau de sucre ribonucléique sessile. Cela favorise une attaque nucléophile par le 2′-O sur l’atome de phosphore (P) plus positivement chargé, créant ainsi un intermédiaire phosphate de ribonucléotide 2′-,3′-cyclique. La création de cet intermédiaire est facilitée par l’imidazole de His119 qui agit comme un acide général, donnant son proton à l’atome d’oxygène dans la liaison sensible P-O-R’.

Pour la deuxième étape de la réaction, les activités acide et base générales des chaînes latérales de ces deux résidus His sont inversées. His12 agit comme un acide général, donnant son proton nouvellement acquis à l’intermédiaire ribonucléotide phosphate 2′-,3′-cyclique, tandis que His119 qui agit comme une base générale, acceptant un proton de l’eau pour promouvoir l’attaque hydroxyle sur le même intermédiaire 2′-,3′-cyclique.

Quel est le site de clivage de la RNase A ?

La RNase A hydrolyse efficacement les contaminants ARN dans les préparations d’ADN en clivant la liaison phosphodiester entre le groupe 3′-phosphate d’un nucléotide pyrimidine (C et U) et le 5′-ribose de son nucléotide adjacent 1, 2, 3. Le phosphodiester 2′-,3′-cyclique intermédiaire qui est généré est ensuite hydrolysé en un groupe 3′-monophosphate. La RNase A pancréatique bovine est une protéine très stable de 124 acides aminés avec sa plus grande activité mesurée envers l’ARN monocaténaire et un taux de clivage deux fois plus rapide au niveau des résidus cytidine par rapport aux résidus uridyle.

Quelle est la réaction de catalyse acide/base de la RNase A?

La RNase A utilise également la catalyse acide/base pour modifier chimiquement ses substrats. Les résidus acides ou basiques de l’enzyme transfèrent des protons vers ou depuis le réactif afin de stabiliser les charges en développement dans l’état de transition. Le transfert de protons crée généralement de meilleurs groupes partants, rendant la réaction plus favorable sur le plan énergétique.

L’histidine est un résidu d’acide aminé très commun impliqué dans la catalyse, car l’histidine a une valeur pKa proche de la neutralité, (pKa=6) ; par conséquent, l’histidine peut à la fois accepter et donner des protons à un pH physiologique.

Quelle est la stabilité de la Ribonucléase A?

La Ribonucléase A est étonnamment stable. Par exemple, dans une procédure de purification de la ribonucléase A du pancréas de vache, les extraits sont traités avec de l’acide sulfurique puis chauffés presque jusqu’à ébullition, et la ribonucléase A est la seule chose qui survit. Ce n’est pas surprenant, car elle est sécrétée par le pancréas et doit accomplir sa tâche dans l’environnement inhospitalier du tube digestif. La stabilité de la ribonucléase A est due en grande partie à quatre ponts disulfure qui collent les différentes parties de la chaîne entre elles.

En général, pour maintenir la stabilité, stockez et manipulez le produit selon les instructions du vendeur.

Comment la RNase A est-elle inactivée ?

La RNase A est une enzyme assez stable et contient 4 ponts disulfure, qui sont présents dans toutes les ribonucléases pancréatiques des mammifères. Lorsque les ponts sont rompus par réduction, la protéine est dénaturée et devient inactive. Lors de la réoxydation, la protéine se replie et l’activité complète est restaurée. Il est toutefois possible de ne réduire les ponts que partiellement et de conserver l’activité enzymatique. L’élimination de 4 peptides à l’extrémité carboxyle détruit l’activité enzymatique.

Qu’est-ce qui inhibe la RNase A ?

Le vanadate d’uridine est un puissant inhibiteur compétitif de la RNase A. Ce qui le rend si puissant est le fait que sa structure mime un état de transition intermédiaire dans la réaction.

Comment prépare-t-on la RNase A à partir du stock ?

La RNase A est généralement préparée en faisant bouillir le stock pendant 10 minutes pour éliminer l’activité DNase contaminante sans affecter la RNase. Le chauffer à 65°C n’affectera pas les RNases.

Comment reconstituer le stock préparé de RNase A?

La RNase A peut être dissoute à une concentration de 1 à 10 mg/ml dans 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 15 mM NaCl, chauffée à 100°C pendant 15 minutes pour inactiver les DNases contaminantes et refroidie lentement à température ambiante et distribuée en aliquotes.

Quelle est la concentration de travail de cette enzyme?

La concentration de travail recommandée de la RNase A est de 1 à 100 µg/mL selon l’application. L’enzyme est active dans une large gamme de conditions de réaction. A de faibles concentrations de sel (0 à 100 mM NaCl), la RNase A clive l’ARN simple brin et double brin ainsi que le brin d’ARN dans les hybrides ARN-ADN.

Quelle est la température de stockage et les mesures de manipulation de ce produit?

Stocker dans un flacon hermétiquement fermé à -20ºC. Une fois ouvert, déshydratez-le sur du gel de silice sous vide avant de le remettre à -20ºC. Soyez prudent lors de la manipulation. N’utilisez pas ce composé si vous n’avez pas reçu une formation complète ou si vous n’êtes pas conscient des risques encourus.

Quelles sont les applications de la RNase A ?

Les RNases ont des rôles importants dans la dégradation et le renouvellement de l’ARN dans tous les organismes. L’enzyme ribonucléase peut dérouler l’hélice d’ARN en se complexant avec l’ARN simple brin.

La RNase A est une endoribonucléase avec des fonctions dans le métabolisme de l’ARN et la régulation de l’expression des gènes.

La RNase A a été trouvée pour jouer des rôles importants dans des maladies telles que les maladies auto-immunes, les insuffisances rénales et les troubles du pancréas. Plus récemment, une activité anti-tumorale a également été rapportée pour une RNase A avec des propriétés cytotoxiques et cytostatiques. Les membres de la superfamille des RNases A sont largement exprimés et présents dans le sérum et les tissus des mammifères.

L’enzyme peut être utilisée pour hydrolyser l’ARN à partir d’échantillons de protéines. Elle est compatible pour une utilisation dans les essais de protection contre la RNase, pour éliminer l’ARN lié de manière non spécifique, dans l’analyse des séquences d’ARN, pour hydrolyser l’ARN contenu dans les échantillons de protéines, et dans la purification de l’ADN.

Quelle est l’apparence/la forme de ce produit?

Fourni sous forme de poudre blanche purifiée par chromatographie, sans sel, lyophilisée. L’apparence/la forme du produit pourrait varier selon le fabricant.

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