Spectrométrie de masse en tandem

La fragmentation des ions en phase gazeuse est essentielle à la spectrométrie de masse en tandem et intervient entre les différentes étapes de l’analyse de masse. Il existe de nombreuses méthodes utilisées pour fragmenter les ions et celles-ci peuvent donner lieu à différents types de fragmentation et donc à différentes informations sur la structure et la composition de la molécule.

Fragmentation à la sourceEdit

Souvent, le processus d’ionisation est suffisamment violent pour laisser aux ions produits une énergie interne suffisante pour se fragmenter au sein du spectromètre de masse. Si les ions produits persistent dans leur état de non-équilibre pendant un temps modéré avant l’auto-dissociation, ce processus est appelé fragmentation métastable. La fragmentation à la source fait référence à l’induction délibérée de la fragmentation à la source en augmentant le potentiel de l’écumeur de la buse sur des instruments généralement basés sur l’électrospray. Bien que la fragmentation à la source permette une analyse par fragmentation, il ne s’agit pas techniquement d’une spectrométrie de masse en tandem, à moins que les ions métastables ne soient analysés en masse ou sélectionnés avant l’auto-dissociation et qu’une deuxième étape d’analyse ne soit effectuée sur les fragments résultants. La fragmentation à la source peut remplacer la spectrométrie de masse en tandem grâce à la technologie EISA (Enhanced in-Source Fragmentation Annotation) qui génère une fragmentation correspondant directement aux données de la spectrométrie de masse en tandem. Les fragments observés par EISA ont une intensité de signal plus élevée que les fragments traditionnels qui subissent des pertes dans les cellules de collision des spectromètres de masse en tandem. L’EISA permet l’acquisition de données de fragmentation sur les analyseurs de masse MS1 tels que les instruments à temps de vol et à quadripôle unique. La fragmentation en source est souvent utilisée en plus de la spectrométrie de masse en tandem (avec fragmentation post-source) pour permettre deux étapes de fragmentation dans une expérience de type pseudo MS3.

Dissociation induite par collisionEdit

La fragmentation post-source est le plus souvent ce qui est utilisé dans une expérience de spectrométrie de masse en tandem. De l’énergie peut également être ajoutée aux ions, qui sont généralement déjà excités vibratoirement, par des collisions post-source avec des atomes ou des molécules neutres, l’absorption de rayonnements, ou le transfert ou la capture d’un électron par un ion à charge multiple. La dissociation induite par collision (DIC), également appelée dissociation activée par collision (DAC), implique la collision d’un ion avec un atome ou une molécule neutre en phase gazeuse et la dissociation ultérieure de l’ion. Par exemple, considérons

AB + + M ⟶ A + B + + M {\displaystyle {\ce {{AB+}+ M -> {A}+ {B+}+ M}}.

où l’ion AB+ entre en collision avec l’espèce neutre M et se sépare ensuite. Les détails de ce processus sont décrits par la théorie des collisions. En raison des différentes configurations instrumentales, deux principaux types de CID sont possibles : (i) le type faisceau (dans lequel les ions précurseurs sont fragmentés à la volée) et (ii) le type piège à ions (dans lequel les ions précurseurs sont d’abord piégés, puis fragmentés).

Un troisième type de fragmentation CID, plus récent, est la dissociation collisionnelle à plus haute énergie (HCD). L’HCD est une technique de CID spécifique aux spectromètres de masse orbitrap dans laquelle la fragmentation a lieu à l’extérieur du piège à ions, elle se produit dans la cellule HCD (dans certains instruments nommés « multipôle de routage des ions »). La HCD est une fragmentation de type piège dont on a démontré qu’elle avait des caractéristiques de type faisceau. Il existe des bases de données de spectrométrie de masse en tandem à haute résolution librement accessibles à grande échelle (par exemple, METLIN avec 850 000 normes moléculaires, chacune avec des données MS/MS CID expérimentales), et sont généralement utilisées pour faciliter l’identification des petites molécules.

Méthodes de capture et de transfert d’électronsEdit

L’énergie libérée lorsqu’un électron est transféré à ou capturé par un ion à charge multiple peut induire une fragmentation.

Dissociation par capture d’électronsEdit

Si un électron est ajouté à un ion positif à charge multiple, l’énergie de Coulomb est libérée. L’ajout d’un électron libre est appelé dissociation par capture d’électrons (DCE), et est représenté par

n + + e – ⟶ ( n – 1 ) + ] ∗ ⟶ fragments {\displaystyle ^{n+}+{\ce {e^{-}->}}\left^{(n-1)+}\right]^{*}{\ce {->fragments}}}

pour une molécule M à protonation multiple.

Dissociation par transfert d’électronsModifié

L’ajout d’un électron par une réaction ion-ion est appelé dissociation par transfert d’électrons (DTE). Semblable à la dissociation par capture d’électrons, l’ETD induit la fragmentation de cations (par exemple, des peptides ou des protéines) en leur transférant des électrons. Elle a été inventée par Donald F. Hunt, Joshua Coon, John E. P. Syka et Jarrod Marto à l’université de Virginie.

L’ETD n’utilise pas d’électrons libres mais emploie des anions radicaux (par exemple l’anthracène ou l’azobenzène) à cette fin :

n + + A – ⟶ ( n – 1 ) + ] ∗ + A ⟶ fragments {\displaystyle ^{n+}+{\ce {A^{-}->}}\left^{(n-1)+}\right]^{*}+{\ce {A->fragments}}}

où A est l’anion.

ETD clive de manière aléatoire le long du squelette peptidique (ions c et z) tandis que les chaînes latérales et les modifications telles que la phosphorylation sont laissées intactes. La technique ne fonctionne bien que pour les ions d’état de charge supérieure (z>2), cependant par rapport à la dissociation induite par collision (CID), l’ETD est avantageuse pour la fragmentation de peptides plus longs ou même de protéines entières. Cela rend cette technique importante pour la protéomique descendante. Tout comme l’ECD, l’ETD est efficace pour les peptides présentant des modifications telles que la phosphorylation.

L’EThcD (Electron-transfer and higher-energy collision dissociation) est une combinaison de l’ETD et de l’HCD où le précurseur peptidique est initialement soumis à une réaction ion/ion avec des anions fluoranthènes dans un piège à ions linéaire, ce qui génère des ions c- et z-. Dans la deuxième étape, la fragmentation HCD tout-ion est appliquée à tous les ions dérivés de l’ETD pour générer des ions b et y avant l’analyse finale dans l’analyseur orbitrap. Cette méthode utilise une double fragmentation pour générer des spectres MS/MS riches en ions et donc en données pour le séquençage des peptides et la localisation des PTM.

Dissociation par transfert d’électrons négatifsEdit

La fragmentation peut également se produire avec une espèce déprotonée, dans laquelle un électron est transféré de l’espèce à un réactif cationique dans une dissociation par transfert d’électrons négatifs (NETD) :

n – + A + ⟶ ( n + 1 ) – ] ∗ + A ⟶ fragments {\displaystyle ^{n-}+{\ce {A+->}}\left^{(n+1)-}\right]^{*}+{\ce {A->fragments}}}

Après cet événement de transfert, l’anion déficient en électrons subit un réarrangement interne et se fragmente. La NETD est l’analogue ion/ion de la dissociation par détachement d’électrons (EDD).

La NETD est compatible avec la fragmentation du peptide et des protéines le long du squelette au niveau de la liaison Cα-C. Les fragments résultants sont généralement des ions produits de type a– et x.

Dissociation par détachement d’électronsEdit

La dissociation par détachement d’électrons (EDD) est une méthode de fragmentation des espèces anioniques en spectrométrie de masse. Elle sert de contre-mode négatif à la dissociation par capture d’électrons. Les ions chargés négativement sont activés par irradiation avec des électrons d’énergie cinétique modérée. Il en résulte une éjection d’électrons de la molécule ionique mère, ce qui provoque une dissociation par recombinaison.

Dissociation par transfert de chargeEdit

La réaction entre les peptides chargés positivement et les réactifs cationiques, également connue sous le nom de dissociation par transfert de charge (CTD), a récemment été démontrée comme une voie de fragmentation alternative à haute énergie pour les peptides à faible état de charge (1+ ou 2+). Le mécanisme proposé de CTD utilisant des cations d’hélium comme réactif est :

1 + + He + ⟶ 2 + ] ∗ + He 0 ⟶ fragments {\displaystyle {\ce {{^{1}+}+He+->}}\left^{2}+}}right]^{*}+{\ce {He^{0}->fragments}}}

Les rapports initiaux sont que la CTD provoque le clivage de la liaison Cα-C du squelette des peptides et fournit des ions produits de type a– et x.

PhotodissociationEdit

L’énergie nécessaire à la dissociation peut être ajoutée par absorption de photons, ce qui entraîne la photodissociation des ions et est représenté par

AB + + h ν ⟶ A + B + {\displaystyle {\ce {{AB+}+{\mathit {h\nu }}->{A}+B+}}.

où h ν {\displaystyle h\nu }

représente le photon absorbé par l’ion. Les lasers ultraviolets peuvent être utilisés, mais peuvent conduire à une fragmentation excessive des biomolécules.

Dissociation multiphotonique infrarougeEdit

Les photons infrarouges vont chauffer les ions et provoquer leur dissociation si suffisamment d’entre eux sont absorbés. Ce processus est appelé dissociation multiphotonique infrarouge (IRMPD) et est souvent réalisé avec un laser à dioxyde de carbone et un spectromètre de masse à piégeage d’ions tel qu’un FTMS.

Dissociation radiative infrarouge du corps noirEdit

Le rayonnement du corps noir peut être utilisé pour la photodissociation dans une technique connue sous le nom de dissociation radiative infrarouge du corps noir (BIRD). Dans la méthode BIRD, toute la chambre à vide du spectromètre de masse est chauffée pour créer de la lumière infrarouge. La méthode BIRD utilise ce rayonnement pour exciter des vibrations de plus en plus énergiques des ions, jusqu’à ce qu’une liaison se rompe, créant des fragments. Cette méthode est similaire à la dissociation multiphotonique infrarouge qui utilise également la lumière infrarouge, mais à partir d’une source différente. La BIRD est le plus souvent utilisée avec la spectrométrie de masse par résonance cyclotronique ionique à transformée de Fourier.

Dissociation induite par la surfaceEdit

Avec la dissociation induite par la surface (SID), la fragmentation résulte de la collision d’un ion avec une surface sous vide poussé. Aujourd’hui, la SID est utilisée pour fragmenter une large gamme d’ions. Il y a quelques années, il n’était courant d’utiliser la DID que sur des espèces de faible masse et à charge unique, car les méthodes d’ionisation et les technologies d’analyse de masse n’étaient pas assez avancées pour former, transmettre ou caractériser correctement les ions à m/z élevé. Au fil du temps, les surfaces de monocouches auto-assemblées (SAM) composées de CF3(CF2)10CH2CH2S sur or ont été les surfaces de collision les plus utilisées pour le SID dans un spectromètre tandem. Les SAM ont été les cibles de collision les plus recherchées en raison de leur masse effective caractéristique importante pour la collision des ions entrants. De plus, ces surfaces sont composées de chaînes fluorocarbonées rigides, qui n’amortissent pas de manière significative l’énergie des ions projectiles. Les chaînes fluorocarbonées sont également bénéfiques en raison de leur capacité à résister au transfert facile d’électrons de la surface métallique vers les ions entrants. La capacité du SID à produire des sous-complexes qui restent stables et fournissent des informations précieuses sur la connectivité est inégalée par toute autre technique de dissociation. Comme les complexes produits par la DSI sont stables et conservent la distribution de la charge sur le fragment, cela produit un spectre unique dans lequel le complexe est centré sur une distribution m/z plus étroite. Les produits SID et l’énergie à laquelle ils se forment reflètent les forces et la topologie du complexe. Les modèles de dissociation uniques aident à découvrir la structure quaternaire du complexe. La distribution de charge symétrique et la dépendance de dissociation sont uniques à la SID et rendent les spectres produits distinctifs de toute autre technique de dissociation.

La technique SID est également applicable à la spectrométrie de masse à mobilité ionique (IM-MS). Trois méthodes différentes pour cette technique comprennent l’analyse de la caractérisation de la topologie, de la connectivité intersous-unités et du degré de dépliage pour la structure des protéines. L’analyse du dépliage de la structure des protéines est l’application la plus couramment utilisée de la technique SID. Pour la spectrométrie de masse à mobilité ionique (IM-MS), la SID est utilisée pour la dissociation des précurseurs activés à la source de trois types différents de complexes protéiques : la protéine C-réactive (CRP), la transthyrétine (TTR) et la concanavaline A (Con A). Cette méthode est utilisée pour observer le degré de dépliage pour chacun de ces complexes. Pour cette observation, le SID a montré les structures des ions précurseurs qui existent avant la collision avec la surface. L’IM-MS utilise le SID comme une mesure directe de la conformation pour la sous-unité de chaque protéine.

La résonance cyclotronique ionique par transformation de Fourier (FTICR) est capable de fournir une ultra-haute résolution et une haute précision de masse aux instruments qui prennent des mesures de masse. Ces caractéristiques font des spectromètres de masse FTICR un outil utile pour une grande variété d’applications telles que plusieurs expériences de dissociation comme la dissociation induite par collision (CID), la dissociation par transfert d’électrons (ETD), et autres. En outre, la dissociation induite par la surface a été mise en œuvre avec cet instrument pour l’étude de la fragmentation fondamentale des peptides. Plus précisément, la DSI a été appliquée à l’étude de l’énergétique et de la cinétique de la fragmentation en phase gazeuse dans un instrument ICR. Cette approche a été utilisée pour comprendre la fragmentation en phase gazeuse des peptides protonés, des ions peptides à électron impair, des complexes ligand-peptide non covalents et des clusters métalliques ligaturés.