Le biophysicien Adam Cohen se promenait à San Francisco, en Californie, en 2010, lorsqu’un appel téléphonique l’a pris par surprise. « Nous avons un signal », a déclaré son interlocuteur. À près de 5 000 kilomètres de là, à Cambridge, dans le Massachusetts, ses collaborateurs ont trouvé de l’or. Après des mois d’expériences infructueuses, les chercheurs avaient trouvé une protéine fluorescente qui leur permettait d’observer les signaux lors de leur passage entre les neurones.
Mais il se passait quelque chose de bizarre. Lorsque Cohen est retourné dans son laboratoire à l’université de Harvard, il a appris que tous les enregistrements de l’expérience montraient une étrange progression. Au début, les neurones décorés avec la protéine clignotaient joliment lorsque les impulsions électriques les traversaient. Mais ensuite, les cellules se sont transformées en gouttes lumineuses. « A mi-chemin de chaque enregistrement, le signal devenait complètement fou », explique Cohen.
Il a donc décidé de rejoindre son équipe lors d’une expérience. « Quand ils commençaient l’enregistrement, ils restaient assis en retenant leur souffle », raconte Cohen. Mais dès qu’ils se rendaient compte que cela fonctionnait, ils faisaient la fête, « en dansant et en courant dans la pièce ».
Dans leur exubérance, ils laissaient la lumière d’une lampe de bureau éclairer directement le microscope. « Nous enregistrions en fait notre excitation », dit Daniel Hochbaum, alors étudiant diplômé dans le groupe de Cohen. Ils ont mis un bémol à leurs réjouissances et, un an plus tard, l’équipe publiait son étude1 – l’une des premières à montrer qu’une protéine fluorescente implantée dans des neurones spécifiques de mammifères pouvait être utilisée pour suivre des impulsions électriques individuelles en temps réel.
Les neuroscientifiques tentent depuis des décennies d’observer les signaux électriques rapides qui sont une composante majeure du langage du cerveau. Bien que les électrodes, le cheval de bataille pour mesurer la tension, puissent enregistrer de manière fiable l’activité de neurones individuels, elles peinent à capter les signaux de plusieurs, en particulier pendant des périodes prolongées. Mais au cours des deux dernières décennies, les scientifiques ont trouvé le moyen d’intégrer des protéines fluorescentes indiquant la tension directement dans les membranes cellulaires des neurones. Avec le bon type de microscope, ils peuvent alors voir les cellules s’illuminer lorsqu’elles communiquent entre elles, que ce soit en chuchotant ou en criant. L’imagerie de tension permet également d’enregistrer le bavardage électrique entre de nombreux neurones à la fois, puis de calculer la moyenne de ces signaux sur de grandes parties du tissu cérébral. Cela aide les chercheurs à étudier l’activité électrique du cerveau à différentes échelles spatiales, en écoutant non seulement les voix des cellules individuelles mais aussi « le rugissement de la foule », explique Cohen.
Au cours des cinq dernières années, les scientifiques ont publié environ 1 000 articles sur le sujet, et des programmes de financement majeurs tels que l’initiative BRAIN des National Institutes of Health américains ont accéléré le développement de nouveaux types d’indicateurs de tension génétiquement modifiés. Dans l’espoir de trouver de meilleures variantes, certains groupes ont mis au point des stratégies permettant de cribler des millions de protéines en fonction des caractéristiques souhaitées, comme la luminosité. L’une de ces approches a permis d’identifier un indicateur deux fois plus lumineux que des capteurs similaires mis au point à peine quatre ans plus tôt2.
A mesure que ces protéines s’améliorent et que les progrès de la microscopie facilitent leur observation, les scientifiques espèrent éclairer la plus grande énigme des neurosciences : comment les cellules du cerveau travaillent ensemble pour transformer un système d’impulsions électriques en pensées, actions et émotions. Les chercheurs ont encore du mal à saisir toute la gamme d’activités et à trouver des moyens de voir les nerfs qui fonctionnent rapidement et profondément dans le tissu cérébral. Mais si les progrès peuvent résoudre ces défis techniques, « ce serait révolutionnaire », déclare Rafael Yuste, qui étudie le fonctionnement des circuits neuronaux à l’université Columbia de New York.
Processus à grande vitesse
Le cerveau humain moyen contient environ 120 milliards de neurones, qui reçoivent et envoient constamment des informations par le biais d’appendices en forme de branches appelés dendrites. Les signaux chimiques ou électriques qui atteignent les dendrites produisent de petites variations de tension à travers la membrane de la cellule, qui sont acheminées vers le corps cellulaire. Lorsque la somme des variations de tension atteint un point de non-retour, appelé seuil, le neurone émet un pic électrique important, un potentiel d’action. Cette secousse se propage à une vitesse pouvant atteindre 150 mètres par seconde le long d’une branche neuronale, appelée axone, jusqu’à un autre ensemble d’appendices ramifiés. Là, des signaux chimiques ou électriques transmettent l’information à l’ensemble suivant de dendrites.
Les signaux neuronaux convergent, divergent et se synchronisent pour produire une symphonie de pensées, d’émotions, d’actions et de réactions, de la rougeur d’un visage au hoquet d’un bébé. Mais les outils d’écoute des scientifiques sont extrêmement limités. Mises au point dans les années 1940, des électrodes miniatures aussi fines qu’un cheveu peuvent être insérées dans le cerveau, contre ou à l’intérieur des neurones, où elles mesurent la tension de la membrane avec précision et rapidité. Mais cette approche ne peut être utilisée que pour surveiller un seul ou une poignée de neurones à la fois – et seulement pendant un temps limité, car les électrodes finissent par endommager la cellule. C’est comme essayer de saisir l’essentiel d’un arrangement orchestral en suivant un seul joueur pendant quelques secondes.
Des faisceaux de micro-électrodes peuvent enregistrer l’activité électrique de 200 cellules à la fois, mais comme ces électrodes sont placées près des neurones plutôt qu’à l’intérieur, elles ne peuvent détecter que les potentiels d’action, les pics les plus aigus de l’activité électrique. Elles sont sourdes aux notes plus douces – les petits changements électriques qui ne poussent pas le neurone jusqu’à un potentiel d’action. Ces changements de tension sous le seuil sont essentiels au fonctionnement du cerveau, car ils s’additionnent progressivement pour déterminer si un neurone va se déclencher ou non.
Dans l’espoir de mesurer une activité cérébrale plus silencieuse dans de plus grandes populations de cellules, les scientifiques ont commencé dans les années 1960 à jouer avec l’idée d’un capteur ou d’une sonde qui fluoresce en réponse à un signal électrique. Les sondes les plus populaires, appelées indicateurs de calcium, s’allument lorsqu’elles se lient au calcium, qui pénètre dans le neurone à la suite d’un pic d’activité électrique. Mais cette technique, connue sous le nom d’imagerie calcique, ne fournit qu’une approximation ; elle n’enregistre pas directement la tension de la membrane. Et bien qu’elle montre le signal des grands événements tels que les potentiels d’action, elle passe à côté d’éléments cruciaux pour le fonctionnement du cerveau, comme les variations subtiles de la tension de la membrane ou les signaux électriques qui inhibent les potentiels d’action. Imaginez que vous ne puissiez entendre qu’une salve d’applaudissements après un concert symphonique : il est clair que l’orchestre a joué, mais ce qu’il jouait, personne ne peut le deviner.
Dans les années 1970, les scientifiques ont commencé à développer des capteurs à colorant qui détectent directement les changements de tension de la membrane. Les premières versions de ces colorants devaient être peintes sur le cerveau sans distinction, de sorte qu’elles marquaient tous les types de cellules, y compris les cellules non neuronales, ce qui rendait difficile l’analyse de l’activité de neurones spécifiques.
Puis, dans les années 1990, les chercheurs ont commencé à tester des indicateurs qui pouvaient être génétiquement modifiés pour n’apparaître que dans les neurones d’intérêt. Le premier3 indicateur de tension génétiquement codé (GEVI) a été mis au point en 1997 ; depuis lors, les scientifiques ont produit plus de deux douzaines de capteurs4. Certains d’entre eux sont fabriqués en combinant une protéine sensible à la tension avec des molécules fluorescentes (voir « Les saveurs de la fluorescence »). Lorsque ces protéines détectent un changement de tension, elles modifient leur structure 3D et altèrent la fluorescence de la molécule à laquelle elles sont couplées. D’autres indicateurs de tension sont des versions mutées des rhodopsines microbiennes, des molécules fluorescentes qui provoquent un changement de tension à travers la membrane plasmique en réponse à la lumière. Ces protéines peuvent également fonctionner en sens inverse, en modifiant leur réponse à la lumière – et donc leur fluorescence – en réponse à un changement de tension de la membrane.
Tout est dans le détail
Jusqu’à présent, les GEVI se sont avérés efficaces pour suivre les potentiels d’action individuels à la fois dans des neurones en culture, cultivés dans un plat, et dans le cerveau intact d’un large éventail d’animaux, des insectes5 aux souris6. L’une des plus grandes promesses de cette technique est sa capacité à enregistrer non seulement les grands événements, mais aussi les petites variations de tension de la membrane, inférieures au seuil, qui reflètent les messages qu’un neurone reçoit des cellules voisines, explique Cohen. « L’imagerie de tension vous permet de voir les entrées des neurones in vivo, ce que nous n’avions aucun moyen de regarder auparavant », dit-il.
Au cours de l’année écoulée, Cohen et ses collègues ont développé de nouveaux GEVI et amélioré les techniques de microscopie pour enregistrer ces changements de tension sous-seuil de nombreux neurones à la fois, y compris dans le cerveau de la souris7,8. L’équipe a également pu enregistrer l’activité électrique de ces mêmes neurones jusqu’à une semaine plus tard. La possibilité de savoir exactement quels neurones sont enregistrés et de les suivre dans le temps permet aux chercheurs d’examiner le câblage entre ces neurones, explique Ed Boyden, neuroscientifique au Massachusetts Institute of Technology à Cambridge. Ce faisant, « vous pouvez relier la structure du cerveau à sa fonction », dit-il. « C’est l’une des questions centrales de toutes les neurosciences. »
Un autre avantage des GEVI est que, contrairement aux électrodes, qui enregistrent principalement les signaux du corps cellulaire, elles peuvent enregistrer les signaux électriques de n’importe quelle partie d’une cellule nerveuse, jusqu’aux extrémités des dendrites (voir « Frapper la balance »). C’est comme si l’on pouvait écouter spécifiquement les notes jouées par la main gauche d’un pianiste. « C’est quelque chose dont je rêve depuis longtemps – et je ne suis pas la seule », déclare Katalin Toth, neurobiologiste à l’université Laval de Québec, au Canada. De nombreux neuroscientifiques s’efforcent de suivre le voltage à travers des neurones entiers pour voir comment il change dans les différentes régions de la cellule, dit-elle.
Wei Wei, neurobiologiste à l’Université de Chicago, dans l’Illinois, utilise les GEVI pour déterminer comment différentes entrées électriques sont intégrées dans les neurones de la rétine de la souris. Wei s’intéresse à une catégorie de neurones qui réagissent plus fortement à un stimulus visuel lorsqu’ils se déplacent dans une direction particulière. En observant comment la tension de la membrane change dans différentes parties de ces neurones, elle espère comprendre comment les cellules additionnent les signaux entrants pour détecter la direction du mouvement.
Le neurophysiologiste Vincent Villette de l’École Normale Supérieure de Paris prévoit d’utiliser des capteurs de tension pour étudier comment les fluctuations régulières de signaux électriques sous-seuil déterminent la façon dont les neurones du cervelet de la souris coordonnent l’activité musculaire. « Il y a beaucoup à comprendre sur la façon dont les cellules agissent ensemble », dit Villette.
La lecture visuelle de la tension de la membrane permet également aux scientifiques de voir les signaux électriques qui inhibent le tir neuronal plutôt que de le déclencher. Comme les signaux inhibiteurs sont impossibles à enregistrer avec des approches telles que l’imagerie calcique, on ne sait pas exactement comment ils façonnent l’activité cérébrale, explique Rosa Cossart, neurobiologiste à l’Institut méditerranéen de neurobiologie de Marseille, en France.
Cossart utilise des électrodes et l’imagerie calcique depuis des années, mais elle est maintenant impatiente d’essayer les GEVI. Elle espère que ces capteurs lui permettront de mesurer le voltage à grande vitesse sur plusieurs neurones – au moins 50 – en même temps chez une souris vivante. Cela aiderait à comprendre comment les groupes de neurones intègrent les signaux électriques – excitateurs et inhibiteurs – pour soutenir des activités cruciales pour le développement et le fonctionnement du cerveau, dit-elle.
De profonds défis
Malgré les attentes élevées, faire fonctionner les GEVIs en laboratoire peut être un tracas. Prenez Helen Yang : alors qu’elle était étudiante diplômée à l’Université Stanford en Californie, elle a décidé d’essayer les GEVI comme moyen d’étudier les neurones du système visuel de la mouche à fruits. Mais en regardant dans le microscope lors de sa première expérience, Yang n’a vu aucun changement dans la fluorescence des cellules, même lorsqu’elle a projeté une lumière vive dans les yeux des mouches. Ce n’est qu’après avoir analysé les données qu’elle a réalisé que les stimuli visuels produisaient un signal, mais un signal minuscule. « J’étais très excitée, mais mes collègues de laboratoire l’étaient moins », dit-elle. « Les réponses étaient plutôt petites et bruyantes. »
Yang a commencé à jouer avec les paramètres du microscope, augmentant la puissance du laser et accélérant l’imagerie. « J’ai fait en sorte qu’il aille aussi vite que notre microscope le pouvait », dit-elle. En effet, la réponse de l’indicateur à un signal électrique est si rapide que le changement de fluorescence n’est détectable que pendant une fraction de seconde. « Si vous ne capturez qu’une seule image pendant le temps où la cellule réagit, la réponse ne semble pas du tout importante », explique Yang.
Yang a finalement réussi à utiliser les GEVI pour étudier comment les neurones des mouches traitent les signaux visuels5, mais le genre de défis auxquels elle a été confrontée a jusqu’à présent empêché l’imagerie de tension de devenir une technique courante. Elle nécessite des plates-formes de microscopie avancées, souvent construites sur mesure, explique Cohen. « Vous ne pouvez pas simplement faire cela sur le microscope fluorescent de votre grand-mère ».
Au cours des cinq dernières années, le soutien financier de l’initiative BRAIN a stimulé les avancées dans le domaine, notamment le développement de meilleurs GEVI, explique Michael Lin, ingénieur en protéines à Stanford.
Parallèlement au développement de nouveaux capteurs, les scientifiques travaillent sur des techniques permettant d’imager avec précision les signaux électriques rapides qui parcourent le cerveau. L’un des défis est que la plupart des techniques disponibles ne fonctionnent bien qu’avec des cellules dans une boîte ou à la surface du cerveau. Mais le cerveau des mammifères n’est pas transparent : en fait, il ressemble à du tofu, explique Na Ji, physicien à l’Université de Californie à Berkeley.
Pour regarder plus profondément, les chercheurs doivent se tourner vers des méthodes plus invasives, comme retirer une partie des tissus sus-jacents ou coller de minuscules dispositifs optiques appelés micro-endoscopes directement dans le cerveau. La microscopie à deux photons est un autre moyen non invasif d’examiner les tissus opaques – jusqu’à un millimètre de profondeur. Cette technique utilise une lumière de plus grande longueur d’onde et de plus faible énergie, qui peut pénétrer plus profondément dans les tissus. Comme les microscopes à deux photons n’éclairent et n’enregistrent qu’un seul point à la fois, ils capturent des images trop lentement pour suivre une grande partie du bavardage rapide du cerveau. Mais les spécialistes sont convaincus que les progrès de la technologie permettront bientôt de voir les signaux produits par les GEVI à plus grande vitesse. « C’est absolument faisable », affirme Ji.
Si les différentes approches parviennent à surmonter ces difficultés, les scientifiques ne doutent pas que l’imagerie de tension deviendra une approche standard pour mesurer l’activité cérébrale. « D’ici un an ou deux, nous verrons beaucoup d’articles qui ont appliqué des capteurs de tension et en ont appris sur la biologie », déclare Thomas Clandinin, neurobiologiste à Stanford. Certains disent que la technique pourrait même remplacer les électrodes pour les questions liées à la façon dont les neurones traitent et intègrent les informations.
Les chercheurs en début de carrière sont particulièrement optimistes : Hochbaum, qui est maintenant boursier postdoctoral à la faculté de médecine de Harvard à Boston, affirme qu’à long terme, les GEVI seront un outil de choix pour étudier comment les différents compartiments de la cellule répondent à des signaux sous-seuil. Il prévoit d’utiliser l’imagerie du voltage pour comprendre comment ces signaux modifient la connexion entre les neurones, un processus clé dans l’apprentissage. Les possibilités sont passionnantes, dit Hochbaum, mais il a tiré au moins une leçon importante de ces premiers jours où il sautait de joie dans le laboratoire après avoir vu une lueur dans un microscope : lorsque les expériences fonctionnent, il faut garder les célébrations au minimum.