Frontiers in Celland Developmental Biology

Figura 1. Sistemul Ran și funcțiile sale moonlighting. (A) Reprezentare schematică a sistemului Ran pentru controlul spațial al proteinelor purtătoare de NLS și NES. În celule, Ran se găsește în două forme, RanGTP (verde) și RanGDP (verde deschis). RCC1 (albastru deschis) promovează schimbul de GDP în GTP, în timp ce RanGAP1-RanBP2 (în roz și violet) promovează hidroliza GTP în GDP. RanGTP se leagă de importine (verde turcoaz) și de exportine (violet deschis). Exportinele în complex cu RanGTP se pot asocia cu proteinele NES (în maro). Pe de altă parte, legarea RanGTP la importine declanșează disocierea acestora de proteinele NLS (galben). (B) În timpul interfazei, sistemul Ran controlează naveta nucleo-citoplasmatică a proteinelor, deoarece RanGTP este predominant în nucleoplasmă, iar RanGDP este predominant în citoplasmă (Sorokin et al., 2007). (C) În timpul mitozei, asocierea lui RCC1, RanGEF, cu cromozomii definește un gradient de concentrații de RanGTP care promovează eliberarea SAF-urilor și nuclearea MT în jurul cromatinei. Sistemul Ran se transformă într-o cale de asamblare și organizare a MT care este esențială pentru asamblarea fusului mitotic. Calea RanGTP depinde de stabilirea unui gradient de concentrație de RanGTP care atinge un vârf în jurul cromozomilor (Kalab et al., 2002; Caudron et al., 2005). (D) La sfârșitul mitozei, sistemul Ran reglează, de asemenea, reasamblarea membranei nucleare și a NPC prin controlul fuziunii membranare și eliberarea componentelor NPC (Walther et al., 2003; Harel et al., 2003). (E) În celulele ciliate, RanGTP se acumulează în cilioplasmă și promovează transportul și acumularea de Kif17 și retinis pigmentosa 2 în cilioplasmă (Dishinger et al., 2010; Fan et al., 2011; Hurd et al., 2011). (F) În neuroni, multe SAF-uri au o funcție. Mai mult, importinele se localizează în spațiul sinaptic dendritic și sunt implicate în transportul de sarcini către nucleu (Jordan și Kreutz, 2009; Panayotis et al., 2015). Sistemul Ran este, de asemenea, activ în axonul nervului sciatic, unde, în urma unei leziuni, importinele promovează transportul încărcăturilor către corpul celular al neuronului (Hanz et al., 2003; Yudin et al., 2008).

Tabel 1. Factori de asamblare a fusului.

În mod interesant, caracterizarea funcțională a unora dintre SAFs oferă informații mecaniciste despre funcțiile căii RanGTP în celula în diviziune. Mecanismul prin care RanGTP promovează nuclearea MT de novo în citoplasma fazei M a fost descris recent (Scrofani et al., 2015). Prin eliberarea TPX2 de la importine, RanGTP promovează interacțiunea acesteia cu Aurora A și cu un complex RHAMM-NEDD1-γTURC (complexul inelar de γTubulină). În acest nou complex, Aurora A activat fosforilează NEDD1, o cerință esențială pentru nuclearea MT. S-a demonstrat că un alt SAF, Mel28, interacționează cu γTuRC și s-a propus ca acesta să joace un rol în nuclearea MT dependentă de RanGTP (Yokoyama et al., 2014). Posibila cooperare a Mel28 cu calea dependentă de TPX2 descrisă mai sus rămâne de stabilit.

Calea RanGTP contribuie, de asemenea, la maturarea centrosomului și la activitatea sa de asamblare a MT (Carazo-Salas et al., 2001). De fapt, s-a demonstrat că două SAF, CDK11 și Mel28, favorizează asamblarea MT la nivelul centrosomului (Yokoyama et al., 2008, 2014).

Identificarea și caracterizarea unei alte SAF, MCRS1, a dezvăluit un mecanism nou și important pentru reglarea dinamicii capătului minus al MT din fibra K (Meunier și Vernos, 2011) și noi perspective asupra rolurilor căii RanGTP în asamblarea fusului și diviziunea celulară (Meunier și Vernos, 2012). MCRS1, în complex cu membri ai complexului modificator de cromatină KAT8-asociat letal nespecific (KANSL) (Meunier et al., 2015), este direcționat către capătul minus al MT dependente de RanGTP, protejându-le de depolimerizare. În cadrul fusului, MCRS1 se asociază, de asemenea, în mod specific cu capetele minus ale MT-urilor din fibrele K și reglează rata de depolimerizare a acestora, jucând un rol esențial în dinamica fibrelor K și în alinierea cromozomilor (Meunier și Vernos, 2011; Meunier et al., 2015). Asocierea specifică a MCRS1 cu MT-urile nucleate prin calea dependentă de RanGTP sugerează, de asemenea, că aceste MT-uri au caracteristici specifice care le disting de MT-urile nucleate de centrosomi. Dacă acest lucru se dovedește a fi adevărat, MT-urile cromozomiale nu ar fi doar o simplă sursă locală de MT-uri care favorizează un mecanism eficient de căutare și capturare, ci ar putea oferi funcționalități unice esențiale necesare pentru asamblarea și funcționarea fusului bipolar (Meunier et al., 2015).

Recent, s-a demonstrat că kineina Kif2a, care depolimerizează MT, este reglată de RanGTP în mitoză, dezvăluind un mecanism important pentru scalarea fusului la dimensiunea celulei în timpul dezvoltării timpurii a embrionilor Xenopus (Wilbur și Heald, 2013). Kif2a este menținută inactivă de importina α până în stadiul 8 al dezvoltării embrionare. Pe măsură ce concentrația solubilă a importinei α scade, Kif2a este eliberată și funcționează ca o depolimerază MT care promovează scurtarea fusului.

Deși, deși, majoritatea SAF-urilor identificate până în prezent s-au dovedit a juca un rol în fazele timpurii ale diviziunii celulare, o serie de rapoarte recente indică faptul că calea RanGTP are alte roluri esențiale care nu sunt direct legate de asamblarea fusului. Într-adevăr, caracterizarea SAF ISWI sugerează funcții pentru calea RanGTP în timpul anafazei (Yokoyama et al., 2009).

Multe linii de cercetare indică, de asemenea, că aceasta joacă un rol în poziționarea fusului. Într-adevăr, înainte de intrarea în anafază, gradientul RanGTP restricționează localizarea complexului LGN-NuMa în zonele cortexului celular mai îndepărtate de cromozomi, contribuind la controlul poziției și orientării fusului (Kiyomitsu și Cheeseman, 2012).

În plus, RanGTP reglează, de asemenea, ținte care nu sunt legate de MT. Într-adevăr, acesta controlează localizarea Anillinei și declanșează alungirea asimetrică a membranei în timpul anafazei, definind poziționarea fusului în centrul celulei în diviziune (Silverman-Gavrila et al., 2008; Kiyomitsu și Cheeseman, 2012). În cele din urmă, în timpul citocinezei, calea RanGTP reglează activitatea kineinei Kif14/Nabkin în formarea pachetelor de actină (Carleton et al., 2006; Samwer et al., 2013) și coordonează reasamblarea membranei nucleare și a NPC (Harel et al., 2003; Walther et al., 2003; Ciciarello et al, 2010; Roscioli et al., 2010; Forbes et al., 2015; Figura 1D).

Este, prin urmare, clar că identificarea și caracterizarea funcțională a țintelor mitotice RanGTP oferă noi perspective asupra mecanismului de asamblare a fusului și a diviziunii celulare. Cu toate acestea, nu este clar dacă mai rămân de identificat multe sau doar câteva ținte RanGTP. Acest număr ar putea fi potențial ridicat, deoarece numărul de proteine nucleare este de ordinul sutelor sau miilor (Dellaire et al., 2003), cu cel puțin un ordin de mărime peste numărul actual de ținte RanGTP cunoscute în celula în diviziune (tabelul 1).

Cele mai multe dintre studiile proteomice care au avut ca scop identificarea de noi SAF-uri s-au concentrat pe importinele α1 și β1 (Nachury et al., 2001; Wiese et al., 2001; Yokoyama et al., 2008), care sunt două dintre cele mai abundente importine în extractele de ouă Xenopus (Bernis et al., 2014; Wuhr et al., 2014). Cu toate acestea, există alte cinci α-importine și alte opt β-importine la om (Cautain et al., 2015).

Deși sunt încă puține, unele date indică faptul că, într-adevăr, și alte importine joacă un rol în timpul diviziunii celulare. S-a demonstrat că reglarea RanGTP a NuSAP depinde de importin-β1 și importin-7 (Ribbeck et al., 2006), iar cea a Mel28, Nup107-160 și Nup98 de importin-β1 și transportin/importin-β2 (Lau et al., 2009). De asemenea, s-a demonstrat în mod specific că transportina reglează în mod negativ asamblarea fusului și reasamblarea membranei nucleare și a NPC (Bernis et al., 2014). Cu toate acestea, nu sunt descriși factori mitotici reglementați exclusiv de importina-7 sau de transportină.

Caracterizarea posibilelor ținte specifice ale transportinei și, mai general, ale celorlalte importine α și β reprezintă un câmp deschis pentru explorare. Acest lucru ar putea fi important pentru a înțelege reglarea căii RanGTP, mai ales având în vedere că modelele de expresie ale importinelor se schimbă semnificativ în diferite stadii de dezvoltare și țesuturi (Hosokawa et al., 2008).

Reglarea sistemului RanGTP în timpul diviziunii celulare

Pe lângă specificitățile interacțiunilor NTR-SAF, mai multe mecanisme pot avea o influență directă asupra căii RanGTP în timpul diviziunii celulare. Mai multe date sugerează că RCC1 însuși este o componentă cheie supusă unei reglementări fine. Celulele umane au trei izoforme de RCC1, care sunt exprimate într-o manieră specifică țesutului (Hood și Clarke, 2007). Izoformele diferă la extremitatea N-terminală, o regiune implicată în legarea importinei și reglementată prin fosforilare, care a fost propusă pentru a influența producția de RanGTP cuplată cu cromozomul (Hood și Clarke, 2007; Li et al., 2007). Mai mult, nivelul de expresie al RCC1 variază, de asemenea, în diferite celule și se corelează cu abruptul gradientului RanGTP (Hasegawa et al., 2013). Acest lucru poate avea consecințe importante, deoarece s-a propus că abruptul gradientului RanGTP determină durata prometafazei și a metafazei, care, la rândul său, poate fi relevantă pentru fidelitatea segregării cromozomilor (Silkworth et al., 2012; Hasegawa et al., 2013).

Alte mecanisme, cum ar fi modificările posttraducționale și splicingul alternativ sunt, de asemenea, strategii potențiale pentru a controla NLS-ul SAF-urilor. Cu toate acestea, aceste mecanisme ar afecta mai degrabă o anumită proteină decât întreaga cale RanGTP.

Recent, a fost propus un mecanism alternativ pentru reglarea SAF-urilor independent de RanGTP. Direcționarea proteinei Golgi GM130 către membranele Golgi fragmentate în mitoză poate concura local TPX2 de la legarea importinei α1, favorizând astfel asamblarea MT în vecinătatea fragmentelor Golgi (Wei et al., 2015). Acest mecanism bazat pe competiție ar putea fi o altă strategie de control local al SAF-urilor sechestrate de importine.

Rolul altor componente ale mașinăriei de navetă nucleo-citoplasmatică în timpul mitozei

Legăturarea RanGTP la exportine stabilizează interacțiunea sa cu proteinele NES-cargo. S-a demonstrat că principala exportină, CRM1, este implicată în direcționarea proteinelor NES către kinetocoro sau centrosomi. La nivelul kinetocorului, CRM1 recrutează complexul RanBP2-RanGAP1-SUMO care este necesar pentru interacțiunea dintre MT și kinetocoru (Arnaoutov et al., 2005). Cu toate acestea, este încă neclar din punct de vedere mecanic modul în care acest complex favorizează interacțiunea MT-kinetochore (Forbes et al., 2015). CRM1 promovează, de asemenea, recrutarea lui RanGAP1-RanBP2 la fus într-o manieră dependentă de RanGTP (Wu et al., 2013) și este implicat în legarea Complexului Pasager al Cromosomului la centromer prin interacțiunea sa directă cu survivina (Knauer et al., 2006). S-a demonstrat, de asemenea, că CRM1 promovează recrutarea lui BRCA1 și a pericentrinei la centrosomii mitotici, promovând astfel activitatea de asamblare MT a centrosomilor (Liu et al., 2009; Brodie și Henderson, 2012). Recent, s-a constatat că represorul transcripțional Bach1 joacă un rol în alinierea brațelor cromozomiale în timpul mitozei și că este exclus din cromozomi în timpul metafazei într-un mod dependent de CRM1 (Li et al., 2012).

Cu toate acestea, semnificația acestor evenimente de direcționare nu este în întregime clară din punct de vedere mecanic (Yokoyama și Gruss, 2013). O problemă majoră este că, în timpul mitozei, rolul putativ al interacțiunilor mediate de exportină poate fi dificil de deslușit de cel al interacțiunilor mediate de importină, deoarece acestea implică proteine care au atât NES, cât și NLS . Cu toate acestea, pare evident că reglarea RanGTP a CRM1 are mai multe roluri în timpul mitozei și va fi interesant de testat dacă și alte exportine sunt importante pentru evenimentele mitotice.

Conservarea căii RanGTP în celulele în diviziune

În ultimii 15 ani, calea RanGTP a fost studiată în mai multe organisme și tipuri de celule. S-a constatat că aceasta prezintă variații la unele detalii sau, în unele cazuri, că nu este necesară. Într-adevăr, în unele sisteme meiotice, contribuția căii RanGTP pare a fi neesențială. De exemplu, spermatozoizii Drosophila pot asambla fusul de meioză I în absența completă a cromozomilor (Bucciarelli et al., 2003). S-a demonstrat, de asemenea, că asamblarea fusului acentrosomal al meiozei I în ovocitele de șoarece și de broască este doar parțial dependentă de calea RanGTP, deși calea este strict esențială pentru asamblarea fusului în timpul meiozei II (Dumont et al., 2007).

Inclusiv în sistemele care se bazează pe RanGTP pentru asamblarea fusului există unele variații cel puțin la nivelul mașinăriei. De exemplu, TPX2, care este esențial la broaște și mamifere, nu este prezent în Caenorhabditis elegans și Drosophila melanogaster. Deși în aceste sisteme au fost identificate proteine cu unele dintre caracteristicile TPX2 (Ozlu et al., 2005; Goshima, 2011), acestora le lipsesc caracteristicile esențiale ale TPX2, cum ar fi un NLS care stă la baza reglării RanGTP. Acest exemplu indică faptul că efectorii căii RanGTP ar putea varia de la un sistem la altul, deși principiile principale sunt probabil menținute și conservate.

The RanGTP Pathway: A Moonlighting Pathway with a Role in Several Cellular Functions

Calea RanGTP este un exemplu de cale întreagă care îndeplinește funcții esențiale în diferite părți ale ciclului celular. În interfază, aceasta orchestrează transportul nucleo-citoplasmatic, în timp ce în mitoză conduce asamblarea fusului și, ulterior, reasamblarea membranei nucleare și a NPC (figurile 1B-D). Proteinele individuale care au funcții diferite în momente diferite sunt definite ca proteine moonlighting (Jeffery, 1999). Calea RanGTP ar putea fi, prin urmare, un exemplu de cale moonlighting.

Calea RanGTP este deosebit de interesantă, deoarece arată modul în care funcția unei proteine depinde de contextul său: majoritatea SAF-urilor au funcții nucleare și sunt ținute separate de tubuline și de alte proteine ale citoscheletului în timpul interfazei. La NEBD, contextul general se schimbă și SAFs exercită funcții importante legate de MTs.

Câteva date indică o funcție de „moonlighting” a căii RanGTP în formarea ciliilor și în transportul în ciliu. S-a demonstrat că RanGTP controlează acumularea de Kif17 și retinis pigmentosa 2 în cilioplasmă (Dishinger et al., 2010; Hurd et al., 2011), unde RanGTP este concentrat (Fan et al., 2011). Modelul de lucru actual este că calea RanGTP orchestrează transportul încărcăturilor care poartă un semnal de localizare a ciliilor prin complexul porilor ciliilor, care a fost propus a fi localizat la baza ciliului (Kee et al., 2012; Figura 1E). Cu toate acestea, sunt necesare studii suplimentare pentru a înțelege cum se stabilește gradientul RanGTP în cili și ce alte încărcături transportă în cili.

În mod interesant, calea RanGTP face lumina lunii și în neuronii diferențiați, unde multe SAF-uri au, de asemenea, o funcție . Mai mult, importinele α și β se acumulează în spațiul sinaptic dendritic și au un rol în transportul încărcăturilor de la sinapse la nucleu (Jordan și Kreutz, 2009; Panayotis et al., 2015). În cele din urmă, s-a demonstrat că un mecanism reglementat de RanGTP este în joc ca răspuns la leziunile nervului sciatic (Hanz et al., 2003; Yudin et al., 2008; Figura 1F).

Concluzii

Identificarea rolului jucat de calea RanGTP în timpul diviziunii celulare a avut loc cu mai mult de 15 ani în urmă. Știm acum că calea RanGTP are funcții suplimentare și ar putea fi considerată o cale moonlighting care controlează diverse procese celulare importante (Figura 1). În timpul diviziunii celulare, aceasta conduce mecanisme esențiale pe care începem să le înțelegem datorită identificării și caracterizării funcționale a țintelor sale directe. Cu toate acestea, mai multe întrebări deschise trebuie să fie încă abordate. Numărul total de SAF-uri este dificil de anticipat și, prin urmare, nu știm câte mai sunt de identificat. În plus, cea mai mare parte a cunoștințelor noastre actuale se limitează la rolul doar al unor componente ale mașinăriei de transport nucleo-citoplasmatic. De exemplu, în prezent se cunosc foarte puține lucruri despre rolul presupus în diviziunea celulară al diferitelor importine prezente în celula umană. Importinele specifice pot reglementa activitatea unor noi SAF-uri, iar diferitele lor modele de exprimare în diferite tipuri de celule și țesuturi pot oferi un mecanism combinatoriu relevant. De asemenea, știm puține lucruri despre rolul presupus al componentelor mașinăriei de export în asamblarea fusului și în alte funcții noi ale căii. Deși există date care sugerează diverse puncte de reglare a căii în sine, consecințele asupra diviziunii celulare și a altor procese nu sunt încă clare și nici modul în care aceasta poate fi adaptată la cerințele diferitelor tipuri de celule sau țesuturi. Studiul căii RanGTP va oferi cu siguranță noi perspective interesante în următorii ani, dezvăluind unele mecanisme esențiale pentru organizarea și funcționarea celulelor.

Contribuții ale autorilor

IV și TC au scris manuscrisul, TC a pregătit tabelul și figura.

Finanțare

TC a fost sprijinit de Ministerul spaniol al Economiei și Competitivității (MINECO) prin intermediul bursei FPI BES-2010-031355. Lucrările din laboratorul Vernos au fost sprijinite de granturile ministerului spaniol BFU2009-10202 și BFU2012-37163, cofinanțate de Fondul European de Dezvoltare Regională (FEDR/FEDER). Recunoaștem, de asemenea, sprijinul Ministerului spaniol al Economiei și Competitivității, „Centro de Excelencia Severo Ochoa 2013-2017”, SEV-2012-0208.

Declarație privind conflictul de interese

Autorii declară că cercetarea a fost efectuată în absența oricăror relații comerciale sau financiare care ar putea fi interpretate ca un potențial conflict de interese.

Recunoștințe

Vrem să mulțumim membrilor laboratorului Vernos pentru discuțiile critice privind diferitele aspecte ale căii RanGTP.

Abbreviații

γTuRC, Complexul inelar de γTubulină; K-Fiber, Kinetochore-Fiber; KANLS, Complex letal nespecific asociat cu KAT8; MT, Microtubuli; NEBD, Descompunerea Învelișului Nuclear; NES, Semnal de Export Nuclear; NLS, Nuclear Localization Signal (semnal de localizare nucleară); NPC, Nuclear Pore Complex (complexul porului nuclear); NTR, Nuclear Transport Receptor (receptor de transport nuclear); RanGAP, Ran GTPase Activating Protein (proteină de activare a Ran GTPase); RanGEF, Ran Guanine nucleotide Exchange Factor (factor de schimb de nucleotide de guanină); SAF, Spindle Assembly Factor (factor de asamblare a fusului).

.