Adam Cohen biofizikus 2010-ben a kaliforniai San Franciscóban sétálgatott, amikor egy telefonhívás váratlanul érte. “Van egy jelünk” – mondta a telefonáló. Közel 5000 kilométerrel arrébb, a massachusettsi Cambridge-ben a munkatársai aranyat találtak. Hónapokig tartó sikertelen kísérletek után a kutatók találtak egy fluoreszkáló fehérjét, amely lehetővé tette számukra, hogy megfigyeljék a jeleket, amint azok az idegsejtek között haladnak.
De valami furcsa dolog történt. Amikor Cohen visszatért a Harvard Egyetemen lévő laboratóriumába, megtudta, hogy a kísérlet összes felvétele furcsa folyamatot mutat. Először a fehérjével díszített neuronok villogtak szépen, amikor elektromos impulzusok suhantak át rajtuk. De aztán a sejtek fényes pacákká változtak. “Az egyes felvételek felénél a jel teljesen elvadult” – mondja Cohen.
Ezért úgy döntött, hogy egy kísérlet során csatlakozik a csapatához. “Amikor elkezdték a felvételt, ott ültek és visszatartották a lélegzetüket” – mondja Cohen. De amint rájöttek, hogy működik, ünnepeltek, “táncoltak és rohangáltak a szobában”.
Lelkesedésükben egy asztali lámpa fényét egyenesen a mikroszkópra engedték. “Tulajdonképpen felvettük az izgalmunkat” – mondja Daniel Hochbaum, aki akkoriban végzős hallgató volt Cohen csoportjában. Visszavettek az ünneplésből, és egy évvel később a csoport közzétette tanulmányát1 – az elsők között, akik kimutatták, hogy egy specifikus emlős neuronokba beépített fluoreszcens fehérjével valós időben nyomon lehet követni az egyes elektromos impulzusokat.
A neurológusok évtizedek óta próbálják megfigyelni a gyors elektromos jeleket, amelyek az agy nyelvének egyik fő összetevőjét képezik. Bár az elektródák, a feszültségmérés munkagépei, megbízhatóan rögzítik az egyes neuronok aktivitását, nehezen tudják sok neuron jeleit rögzíteni, különösen hosszabb ideig. Az elmúlt két évtizedben azonban a tudósok megtalálták a módját annak, hogy fluoreszkáló, feszültséget jelző fehérjéket közvetlenül a neuronok sejtmembránjába ágyazzanak. A megfelelő mikroszkóppal aztán láthatják, ahogy a sejtek világítanak, miközben beszélgetnek egymással – akár suttogva, akár kiabálva. A feszültség-képalkotás sok neuron közötti elektromos beszélgetést is rögzíthet egyszerre, majd ezeket a jeleket az agyszövet nagy darabjain átlagolhatja. Ez segít a kutatóknak abban, hogy az agy elektromos aktivitását különböző térbeli skálákon tanulmányozhassák, nemcsak az egyes sejtek hangját, hanem “a tömeg üvöltését” is meghallgatva – mondja Cohen.
Az elmúlt 5 évben a tudósok mintegy 1000 tanulmányt publikáltak a témában, és az olyan jelentős finanszírozási programok, mint az amerikai Nemzeti Egészségügyi Intézetek BRAIN kezdeményezése, felgyorsították az új típusú, genetikailag módosított feszültségjelzők fejlesztését. A jobb változatok megtalálásának reményében egyes csoportok olyan stratégiákat dolgoztak ki, amelyekkel több millió fehérjét szűrnek a kívánt jellemzők, például a fényerő szempontjából. Az egyik ilyen megközelítés olyan jelzőt azonosított, amely kétszer olyan fényes, mint az alig négy évvel korábban kifejlesztett hasonló érzékelők2.
Amint ezek a fehérjék javulnak, és a mikroszkópia fejlődése megkönnyíti a megfigyelésüket, a tudósok remélik, hogy megvilágítják az idegtudomány legnagyobb rejtélyét: hogyan működnek együtt az agy sejtjei, hogy az elektromos impulzusok rendszerét gondolatokká, cselekvésekké és érzelmekké alakítsák. A kutatók még mindig küzdenek azért, hogy a tevékenység teljes skáláját megragadják, és hogy módot találjanak arra, hogy az agyszövet mélyén gyorsan és mélyen tüzelő idegeket lássák. De ha a fejlődés meg tudja oldani ezeket a technikai kihívásokat, “az forradalmi lenne” – mondja Rafael Yuste, aki a New York-i Columbia Egyetemen az idegi áramkörök működését tanulmányozza.
Nagysebességű folyamat
Az átlagos emberi agy mintegy 120 milliárd neuront tartalmaz, amelyek folyamatosan fogadják és küldik az információkat a dendriteknek nevezett ágszerű függelékeken keresztül. A dendritekhez érkező kémiai vagy elektromos jelek kis feszültségváltozást idéznek elő a sejtmembránon keresztül, amelyek a sejttestbe jutnak. Amikor a feszültségváltozások összege elér egy küszöbértéknek nevezett pontot, ahonnan már nincs visszaút, a neuron egy nagy elektromos tüskét – akciós potenciált – lő ki. Ez a lökés másodpercenként akár 150 méteres sebességgel száguld végig a neuron egy axonnak nevezett ágán egy másik elágazó függelékhez. Itt kémiai vagy elektromos jelek továbbítják az információt a dendritek következő csoportjához.
A neuronális jelek összefutnak, szétválnak és szinkronizálódnak, hogy gondolatok, érzelmek, cselekvések és reakciók szimfóniáját hozzák létre, az arc kipirulásától a csecsemő csuklásáig. A tudósok hallgatási eszközei azonban rendkívül korlátozottak. Az először az 1940-es években kifejlesztett, hajszálvékony miniatűr elektródákat be lehet vezetni az agyba, a neuronokhoz vagy azok belsejébe, ahol precízen és gyorsan mérik a membránok feszültségét. Ezzel a módszerrel azonban egyszerre csak egy vagy egy maroknyi neuront lehet megfigyelni – és csak korlátozott ideig, mert az elektródák végül károsítják a sejtet. Olyan ez, mintha egy zenekari hangszerelés lényegét próbálnánk megismerni egy játékos néhány másodperces követésével.
Mikroelektródák kötegei egyszerre akár 200 sejt elektromos aktivitását is képesek rögzíteni, de mivel ezeket az elektródákat nem a neuronok belsejében, hanem azok közelében helyezik el, csak az akciós potenciálokat, az elektromos aktivitás legélesebb tüskéit képesek érzékelni. Süketek a lágyabb hangokra – azokra az apró elektromos változásokra, amelyek a neuront nem juttatják el egészen az akciós potenciálig. Ezek a küszöbérték alatti feszültségváltozások kulcsfontosságúak az agyműködés szempontjából, mert fokozatosan összeadódva határozzák meg, hogy egy neuron tüzelni fog-e vagy sem.
Abban a reményben, hogy nagyobb sejtpopulációkban mérhetik a csendesebb agyi aktivitást, a tudósok az 1960-as években olyan érzékelő vagy szonda ötletével kezdtek el játszani, amely elektromos jelre reagálva fluoreszkál. A legnépszerűbb szondák, az úgynevezett kalciumindikátorok akkor világítanak, amikor kalciumhoz kötődnek, amely az elektromos aktivitás kiugrása következtében áramlik az idegsejtbe. A kalcium-képalkotás néven ismert technika azonban csak közvetítő adatot szolgáltat; közvetlenül nem rögzíti a membránfeszültséget. És bár megmutatja a nagy események, például az akciós potenciálok jelét, az agyműködés szempontjából döntő fontosságú dolgokat, például a membránfeszültség finom kilengéseit vagy az akciós potenciálokat gátló elektromos jeleket nem veszi észre. Képzeljük el, hogy egy szimfonikus koncert után csak egy kitörő tapsot hallunk: egyértelmű, hogy a zenekar fellépett, de hogy mit játszott, azt csak találgatni lehet.
A hetvenes években a tudósok olyan festékszenzorok kifejlesztésébe kezdtek, amelyek közvetlenül érzékelik a membránfeszültség változásait. Ezeknek a festékeknek az első változatait válogatás nélkül kellett az agyra festeni, így minden sejttípust megjelöltek, beleértve a nem neuronális sejteket is, ami megnehezítette az egyes neuronok aktivitásának elemzését.
Az 1990-es években aztán a kutatók olyan mutatókat kezdtek tesztelni, amelyeket genetikailag úgy lehetett módosítani, hogy csak az érdeklődésre számot tartó neuronokban jelenjenek meg. Az első3 genetikailag kódolt feszültségindikátort (GEVI) 1997-ben fejlesztették ki; azóta a tudósok több mint két tucat érzékelőt4 gyártottak. Ezek némelyike feszültségérzékeny fehérje és fluoreszcens molekulák kombinálásával készült (lásd “A fluoreszcencia ízei”). Amikor ezek a fehérjék feszültségváltozást érzékelnek, megváltoztatják 3D szerkezetüket és a hozzájuk kapcsolt molekula fluoreszcenciáját. Más feszültségindikátorok a mikrobiális rodopszinok mutált változatai, fluoreszcens molekulák, amelyek fény hatására feszültségváltozást okoznak a plazmamembránon keresztül. Ezek a fehérjék fordítva is működhetnek, a membránfeszültség változására reagálva megváltoztatják a fényre adott válaszukat – és így a fluoreszcenciájukat is -.
Minden a részletekben
A GEVI-k eddig sikeresnek bizonyultak az egyes akciós potenciálok követésében mind a tenyésztett, tányérban növesztett neuronokban, mind az állatok széles körének ép agyában, a rovaroktól5 az egerekig6. Cohen szerint a technika egyik legnagyobb ígérete, hogy nemcsak a nagy események, hanem a membránfeszültség apró, küszöbérték alatti változásainak rögzítésére is alkalmas, amelyek a neuron által a szomszédos sejtektől kapott üzeneteket tükrözik. “A feszültség képalkotás lehetővé teszi, hogy in vivo lássuk a neuronok bemeneteit, amire korábban nem volt módunk” – mondja.
Az elmúlt évben Cohen és munkatársai új GEVI-ket és továbbfejlesztett mikroszkópiai technikákat fejlesztettek ki, hogy egyszerre sok neuron ilyen küszöb alatti feszültségváltozásait rögzítsék, többek között az egér agyában7,8. A csoport képes volt ugyanezen neuronok elektromos aktivitását akár egy héttel később is rögzíteni. Ed Boyden, a cambridge-i Massachusetts Institute of Technology idegkutatója szerint az a képesség, hogy pontosan tudják, mely neuronokat rögzítik, és idővel nyomon tudják követni őket, lehetővé teszi a kutatók számára, hogy megvizsgálják a neuronok közötti vezetékeket. Ezáltal “összekapcsolható az agy szerkezete és működése” – mondja. “Ez az egyik legfontosabb kérdés az egész idegtudományban.”
A GEVI-k másik előnye, hogy az elektródákkal ellentétben, amelyek elsősorban a sejttest jeleit rögzítik, az idegsejtek bármely részéből, egészen a dendritek csúcsáig képesek elektromos jeleket rögzíteni (lásd: “A mérleg nyelve”). Ez olyan, mintha kifejezetten a zongorista bal keze által játszott hangokat tudnánk hallgatni. “Ez olyasmi, amiről már régóta álmodozom – és ezzel nem vagyok egyedül” – mondja Toth Katalin, a kanadai Quebec Cityben található Laval Egyetem neurobiológusa. Sok idegtudós arra törekszik, hogy egész neuronokon keresztül kövesse a feszültséget, hogy lássa, hogyan változik az a sejt különböző régióiban, mondja.
Wei Wei, az illinois-i Chicagói Egyetem neurobiológusa a GEVI-k segítségével dolgozza ki, hogyan integrálódnak a különböző elektromos bemenetek az egér retina neuronjaiban. Wei a neuronok egy olyan osztálya iránt érdeklődik, amely erősebben reagál egy vizuális ingerre, ha az egy bizonyos irányba mozog. Azzal, hogy megvizsgálja, hogyan változik a membránfeszültség ezen neuronok különböző részeiben, reméli, hogy megérti, hogyan összegzik a sejtek a beérkező jeleket a mozgás irányának érzékeléséhez.
A párizsi Ecole Normale Supérieure neurofiziológusa, Vincent Villette azt tervezi, hogy feszültségérzékelők segítségével tanulmányozza, hogy a küszöbérték alatti elektromos jelek rendszeres ingadozása hogyan határozza meg, hogy az egér kisagyban lévő neuronok hogyan koordinálják az izomtevékenységet. “Még sok mindent meg kell érteni arról, hogyan működnek együtt a sejtek” – mondja Villette.
A membránfeszültség vizuális leolvasása azt is lehetővé teszi a tudósok számára, hogy olyan elektromos jeleket lássanak, amelyek inkább gátolják a neuronok tüzelését, mint kiváltják azt. Mivel a gátló jeleket nem lehet rögzíteni az olyan megközelítésekkel, mint a kalcium képalkotás, nem világos, hogy pontosan hogyan alakítják az agyi aktivitást, mondja Rosa Cossart, a franciaországi Marseille-i Mediterrán Neurobiológiai Intézet neurobiológusa.
Cossart évek óta használ elektródákat és kalcium képalkotást, de most már nagyon szeretné kipróbálni a GEVI-ket. Reméli, hogy ezek a szenzorok lehetővé teszik számára, hogy nagy sebességgel mérje a feszültséget több neuronon – legalább 50 – egyidejűleg egy élő egérben. Ez segítene megérteni, hogyan integrálják az idegsejtek csoportjai az elektromos jeleket – mind a gerjesztő, mind a gátló jeleket – az agy fejlődéséhez és működéséhez elengedhetetlen tevékenységek támogatása érdekében, mondja.
Mély kihívások
A nagy elvárások ellenére a GEVI-k működésre bírása a laboratóriumban nehézségekbe ütközhet. Vegyük Helen Yangot: a kaliforniai Stanford Egyetem végzős hallgatójaként úgy döntött, hogy kipróbálja a GEVI-ket, mint a gyümölcslégy látórendszerének neuronjait vizsgáló módszert. Első kísérlete során azonban a mikroszkópon keresztül nézve Yang nem látott változást a sejtek fluoreszcenciájában, még akkor sem, amikor erős fényt villantott a legyek szemébe. Csak az adatok elemzése után jött rá, hogy a vizuális ingerek jelet keltenek, csak éppen egy aprócska jelet. “Én eléggé izgatott voltam, de a labortársaim már kevésbé” – mondja. “A válaszok elég kicsik és zajosak voltak.”
Yang elkezdett játszani a mikroszkóp beállításaival, növelte a lézer teljesítményét és felgyorsította a képalkotást. “Alapvetően olyan gyorsan csináltam, amilyen gyorsan a mikroszkópunk képes volt” – mondja. Ez azért volt így, mert az indikátor elektromos jelre adott válasza olyan gyors volt, hogy a fluoreszcencia változása csak a másodperc töredékéig volt kimutatható. “Ha csak egy képkockát rögzítünk az alatt az idő alatt, amíg a sejt reagál, a válasz egyáltalán nem tűnik nagynak” – mondja Yang.
Yangnak végül sikerült a GEVI-ket arra használnia, hogy megvizsgálja, hogyan dolgozzák fel a legyek neuronjai a vizuális jeleket5 , de az a fajta kihívás, amellyel szembesült, eddig megakadályozta, hogy a feszültséges képalkotás általánosan elterjedt technikává váljon. Cohen szerint ehhez fejlett, gyakran egyedi mikroszkópos platformokra van szükség. “Ezt nem lehet csak úgy megcsinálni a nagymama fluoreszcens mikroszkópján”.
Az elmúlt öt évben a BRAIN kezdeményezés pénzügyi támogatása fellendítette a terület fejlődését, beleértve a jobb GEVI-k fejlesztését, mondja Michael Lin, a Stanford fehérjemérnöke.
Az új érzékelők fejlesztésével párhuzamosan a tudósok olyan technikákon dolgoznak, amelyekkel pontosan leképezhetők az agyon keresztülhaladó gyors elektromos jelek. Az egyik kihívás az, hogy a rendelkezésre álló technikák többsége csak a csészében vagy az agy felszínén lévő sejtekkel működik jól. Az emlősök agya azonban nem átlátszó: valójában olyan, mint a tofu, mondja Na Ji, a Berkeley-i Kaliforniai Egyetem fizikusa.
Ahhoz, hogy mélyebbre lássanak, a kutatóknak invazívabb módszerekhez kell folyamodniuk, mint például a fedőszövet egy részének eltávolítása vagy a mikro-endoszkópnak nevezett apró optikai eszközök közvetlenül az agyba dugása. Egy alternatív, nem invazív módszer az átlátszatlan szövetekbe való betekintésre – akár 1 milliméter mélyre – a kétfoton-mikroszkópia. Ez a technika hosszabb hullámhosszú, alacsonyabb energiájú fényt használ, amely mélyebbre tud hatolni a szövetekbe. Mivel a kétfotonos mikroszkópok egyszerre csak egyetlen pontról világítanak és rögzítenek, túl lassan készítenek képeket ahhoz, hogy az agy gyors beszélgetéseinek nagy részét nyomon követhessék. A szakemberek azonban bíznak abban, hogy a technológia fejlődése hamarosan lehetővé teszi, hogy a GEVI-k által keltett jeleket nagyobb sebességgel lássák. “Ez abszolút megvalósítható” – mondja Ji.
Ha a különböző megközelítések képesek leküzdeni ezeket a kihívásokat, a tudósok nem kételkednek abban, hogy a feszültségképalkotás az agyi aktivitás mérésének standard megközelítésévé válik. “A következő egy-két évben rengeteg olyan cikket fogunk látni, amelyekben feszültségérzékelőket alkalmaztak és biológiai ismereteket szereztek” – mondja Thomas Clandinin, a Stanford neurobiológusa. Egyesek szerint a technika akár az elektródákat is helyettesítheti a neuronok információfeldolgozásával és -integrálásával kapcsolatos kérdésekben.
A pályakezdő kutatók különösen optimisták: Hochbaum, aki jelenleg a bostoni Harvard Medical School posztdoktori ösztöndíjasa, azt mondja, hogy hosszú távon a GEVI-k lesznek a legjobb eszközök annak tanulmányozására, hogy a sejt különböző kompartmentjei hogyan reagálnak a küszöbérték alatti jelekre. Azt tervezi, hogy a feszültségképalkotás segítségével megérti, hogyan változtatják meg az ilyen jelek az idegsejtek közötti kapcsolatot, ami a tanulás kulcsfontosságú folyamata. A lehetőségek izgalmasak, mondja Hochbaum, de legalább egy fontos leckét megtanult azokból a korai napokból, amikor a mikroszkópban látott csillogás után vidáman ugrált a laborban: amikor a kísérletek működnek, az ünneplést tartsuk a minimumon.