Isolation and Identification of Volatiles
Az emberi orr sok VOC-ot szagként érzékel, és ezek a szagok gyakran az első jelei annak, hogy penészgombák vannak jelen. A VOC-ok kémiai jellemzése (izolálása, elválasztása, azonosítása és mennyiségi meghatározása) azonban speciális analitikai módszereket igényel, amelyek eltérnek a hagyományos “nedves” kémiában alkalmazott megközelítésektől. A 20. század végén és a 21. század elején bekövetkezett technológiai fejlődés javította az illékony anyagok pontos, precíz és alacsony koncentrációjú kimutatására vonatkozó képességeinket (Zhang és Li, 2010; Hung et al., 2015). Röviden, a hagyományos módszerek gőzdesztillációt és folyadék-folyadék extrakciót foglalnak magukban, amelyet az egyes vegyületek koncentrálása és kémiai ellenőrzése követ. A VOC-k kémiai természetét vizsgáló legkorábbi tanulmányok némelyike metilén-kloridos kivonatokkal készült, amelyeket vízgőzdesztillációval koncentráltak, majd gáz-folyadék kromatográfiával és tömegspektrometriával (MS) elemeztek. Egy korai, ezt a megközelítést alkalmazó vizsgálatban az Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus oryzae és Aspergillus parasiticus VOC-jait elemezték. Mind a négy faj 3-metil-butanolt, 3-oktanont, 3-oktanolt, 1-oktén-3-olt, 1-okténol és 2-oktén-1-olt termelt. Az A. niger esetében az azonosított VOC-keverék több mint 90%-a 1-oktén-3-olból állt, amely az a szagvegyület, amely a gombák jellegzetes szagát adja. Az A. parasiticus esetében az 1-oktén-3-ol az összes illékony keverék 35,6%-át tette ki, míg a rokon nyolc szénatomos vegyület, a 2-oktén-1-ol, amelynek kellemetlen dohos-olajos szaga van, 34,8%-ot alkotott (Kamiński et al., 1974).
A módszerek azóta a gázkromatográfia-tömegspektrometriára (GC-MS) támaszkodnak, amely egyesíti a kromatográfiás elválasztást, a tömegspektrum és a kromatográfiás retenció alapján történő azonosítást és az illékony minták mennyiségi meghatározását. A gombakultúrák fejterében lévő VOC-okat általában szilárd szorptív anyagokkal, például aktív szénnel vagy rosttal gyűjtik össze. Mindegyik gyűjtési módszernek vannak veleszületett torzításai, és lehetővé tehetik a műtermékképződést; általában a nem poláros vegyületeket előnyben részesítik a polárosakkal szemben. A gázkromatográfia is okozhat hibákat, mivel néha nehéz két vegyületet egymástól elválasztani, ami a vegyületek összemosódását eredményezi. Ezt figyelték meg a 2-metil-1-butanol és a 3-metil-1-butanol esetében, amelyek izomerjei csak egy metilcsoport áthelyezésében különböznek (Börjesson et al., 1992). A GC-MS analízis további hátrányai közé tartozik a képzett kezelőszemélyzet szükségessége, a relatív költség, valamint az a tény, hogy nem hatékony a reaktívabb VOC-k esetében (Elke és mtsai., 1999; Gao és mtsai., 2002; Gao és Martin, 2002; Rappert és Müller, 2005).
A szilárd fázisú mikroextrakció (SPME) népszerű és hordozható módszer. A VOC-okat először egy szálon abszorbeálják és koncentrálják, majd később a detektorba juttatják, ahol a deszorpció magában a GC-injektorban történik. Az SPME jól alkalmazható környezeti minták vételére, amelyeket aztán azonosítás céljából visszaszállítanak a laboratóriumba. GC-MS-szel párosítva kényelmes és széles körben használt eszköz a VOC-k minőségi azonosítására mikrobiális kultúrákból vagy szennyezett épületekből (Fiedler és mtsai., 2001; Wady és mtsai., 2003; Jeleń és Grabarkiewicz-Szczesna, 2005). Az SPME gyakran a legjobb megközelítés egy megcélzott illékony vegyület relatív mennyiségének meghatározására feltáró helyzetben vagy ismétlődő mintavételi folyamatok esetén. Új vegyületek azonosítására azonban nem alkalmas.
Számos speciális analitikai módszert fejlesztettek ki, amelyek kiegészítik a klasszikus GC-MS megközelítéseket, és hasznosak lehetnek a célzott elemzésekhez. Például a protonátviteli reakció-tömegspektrometria (PTR-MS) hasznos a gyors mintavételhez és az alacsony koncentrációk kimutatásához (Kamysek et al., 2011; Schwoebel et al., 2011). Ezt a módszert a környezettudományban, az élelmiszer-technológiában és az orvosi diagnosztikában alkalmazzák (Gasperi et al., 2001; Cappellin et al., 2013).
A termikus deszorpciós (TD)-gázkromatográfia/masszaspektroszkópia alkalmazásával jellemezték az Aspergillus fumigatus in vitro illékony metabolitprofilját, amely a monoterpén kámfén, α- és β-pinen és limonén; valamint a szeszkviterpén vegyületek α- és β-trans-bergamotén (Koo et al., 2014).
A szelektált ionáramlási cső-tömegspektrometria (SIFT-MS) képes a mikrobiális VOC-k gyors és érzékeny kimutatására mérsékelten összetett gázelegyben. Képes a VOC-okat alacsony milliárdrész-koncentrációban megcélozni, és bizonyos vegyületeket a billiórész-tartományban is képes mérni. Ennél a technikánál az összes VOC ionizálódik egy áramlási csőben, nem igényel kromatográfiás elválasztást (Syhre et al., 2008; Chambers et al., 2011). A módszert az A. fumigatus által kibocsátott VOC-k mennyiségi meghatározására használták olyan baktériumokkal való kokultúrában, amelyek gyakran megtalálhatók a beteg emberi tüdőben. Az A. fumigatus-szal végzett tenyészetek “bőséges” mennyiségű ammóniát és a kénorganikus vegyületeket, a metanethiolt (más néven metil-merkaptánt), dimetil-szulfidot és dimetil-diszulfidot termeltek (Chippendale et al., 2014).
A szimultán desztillációs extrakció (SDE) szerves anyaggal borított rövid szilikaszálat tartalmaz állófázisként a VOC-k koncentrálására, amelyeket aztán forró injektorban deszorbeálnak. Az SDE-t illékony komponensek meghatározására használják környezeti, élelmiszer-, törvényszéki, olaj-, gyógyszer- és polimerelemzésekben, hogy koncentráltabb mintákat kapjanak (Orav et al., 1996). Például bizonyos aromavegyületeket az SDE és az SPME kombinációjával vizsgáltak. Az aromavegyületek SDE-vel kvantitatív módon elemezhetők, míg az SPME-t egyszerű, gyors, rutinszerű szűrésre használják (Cai és mtsai., 2001).
A multikapilláris oszlop-ionmobilitás spektrométer (MCC-IMS) érzékenysége a billió rész per billió tartományba esik, nagy sebességű, és alacsony technikai tudást igényel. Az A. fumigatus és Candida fajok jellegzetes metabolitjait ezzel a módszerrel különböztették meg a fejtérelemzésben (Perl és mtsai., 2011).
Az elektronikus orrok (e-noses) az illékony anyagokat elektronikus felületekkel való kölcsönhatás alapján elektromos jelekké alakítják, és ismert vegyületek kimutatására használhatók. Az e-nózok különböző szelektivitású kémiai érzékelők egy csoportjából, egy jel-előfeldolgozó egységből és egy minta-megkülönböztető rendszerből állnak (Gardner és Bartlett, 1994). A különböző VOC-ok jellegzetes ujjlenyomatot alkotnak, amelyet a felismerő rendszerben korábban rögzített mintákkal való összehasonlítással lehet megkülönböztetni. Az e-nózok orvosi alkalmazása eredetileg bakteriális kórokozókra vagy nem fertőző betegségekre, például tüdőrákra, krónikus obstruktív tüdőbetegségre és asztmára összpontosított (Valera et al., 2012). Az alkalmazástól függően tamponból, köpetből, szérumból, székletből, leheletből vagy vizeletből származó VOC-mintákat használnak diagnosztikai célokra. A légzésmintákat az aszpergillózis korai kimutatására használták (de Heer és mtsai., 2013).
A gombás VOC-okkal való munka során továbbra is számos technikai kihívás merül fel, és gyakran nehéz a különböző laboratóriumok között kapott eredmények összehasonlítása. Ugyanazon gombafajok ismeretlen vagy nem ellenőrzött környezeti és genetikai tényezők alapján eltérő VOC-profilokkal rendelkezhetnek. Továbbá az alkalmazott kísérleti protokoll drasztikusan befolyásolhatja a VOC-profilt. Például az Aspergillus flavuson végzett munkájuk során de Lucca és munkatársai (2010) csak egy terpént mutattak ki, amikor SPME-t használtak az illékony anyagok összegyűjtésére, mielőtt GC-MS-nek vetették volna alá azokat. Később egy mintakoncentrátort alkalmazva, mielőtt egy másik GC-MS műszermodellnek alávetették volna, a csoport több terpént is fel tudott fedezni (de Lucca et al., 2012). Az anyagok kezelésének módja a kísérletezés előtt artefaktumokat eredményezhet, az autoklávozás pedig nem biogén illékony anyagok képződését okozhatja (Börjesson et al., 1992). Mivel az adatok gyakran nem következetesek az egyes kísérletek között, egyes szerzők megkérdőjelezték a mikrobiális VOC-kibocsátás reprodukálhatóságát (Schleibinger et al., 2002). A gombás VOC-kkal kapcsolatos jövőbeli munkáknak tisztában kell lenniük azzal a sok tényezővel, amely befolyásolhatja az eredményeket. Hasznos lenne, ha a gombás VOC-kat vizsgáló tudósok közössége iránymutatásokat dolgozna ki a legjobb gyakorlatokra vonatkozóan.