18O jelölés: a proteomika eszköze

Bemutatjuk a fehérjék proteolitikus jelölésének és mennyiségi meghatározásának értékelését diagnosztikai célokra tripszin és 18O-val dúsított H2O segítségével. Bemutatjuk, hogy ezzel a megközelítéssel hatékonyan végezhető összehasonlító vagy relatív kvantitáció. Olyan protokollt dolgoztunk ki, amely lehetővé teszi a jelölt peptidek konzerválását természetes bőségű vízben a visszaalakítástól való félelem nélkül, feltéve, hogy a pH elég alacsony a tripszin katalitikus aktivitásának elfojtásához, de nem olyan alacsony, hogy elősegítse a kémiai visszaalakítást. Mivel a jelölés hatékonysága a peptid jellegétől függ, nem létezik egyszerű lineáris kapcsolat a 16O/18O emésztési pufferkeverék relatív tartalma (x) és a jelölés hatékonysága (y) között; inkább egy valószínűségen alapuló y = x(2) összefüggést követ. Így a peptidjelölés mértéke a 16O/18O emésztési pufferkeverék arányok alkalmazásával jelentősen eltérhet a lineáris összefüggés alapján várttól. A relatív Ziptip-hatékonyság értékelése azt mutatta, hogy a peptidkoncentráció csökkentésével a minta visszanyerése csökken a normál körülmények között, ami arra utal, hogy van egy határ, amely alatt csökkenő hozamot lehet elérni. Ezenkívül a Speedvac kiszáradásából és a visszanyerésből eredő adszorpciós veszteségek szerény (20%) veszteségeket jeleztek, amelyek peptidenként nagymértékben (0-50%) változhatnak. A standard fehérjekeverékek oldatban történő emésztési hatékonysága a koncentráció függvényében lineáris csökkenést mutatott a koncentráció csökkenésével. Ez összhangban van az enzimkinetikai hatásokkal, és kiemeli azt a lehetséges mennyiségi hibát, amely a peptidek kimutatásán alapuló differenciális expresszió értékelésénél felmerülhet. Vizsgálataink eredményei bizonyítják a 18O-jelölés, mint a proteomikai folyamatok fejlesztésének optimalizálási eszközének erejét.