A 130 és 131 fehérjék 14-3-3-ként való azonosítása, jellemzése és igazolása
1. ábra.
1. ábra. Az ezüsttel szennyezett gélek 130 és 131 fehérjefoltokat mutató régiói kétdimenziós elektroforézis után.
A tábla A normális liquort mutat, a 130-as és 131-es foltok hiányoznak. A B panel egy Creutzfeldt-Jakob-kórban szenvedő beteg agy-gerincvelői folyadékát mutatja; a nyilak a 130-as és 131-es foltokra mutatnak. A C és D panelen látható gélek normál emberi agy kivonatából származnak. Az A, B és C panelek ugyanazt a gél régiót mutatják, az x tengelyen 4,8 és 6,0 közötti izoelektromos pontokkal (balról jobbra), az y tengelyen pedig 10 és 40 kd közötti méretekkel (alulról felfelé). A C panel szaggatott doboza körvonalazza a D panelben látható régiót egy 4,5 és 5,4 közötti pH-tartományú gélből. A B és C panelben a nyilak a 130-as és 131-es foltok helyét jelzik, amelyek a D panelben vannak jelölve.
A 130-as és 131-es cerebrospinalis folyadékfehérjék kimutatására szolgáló kétdimenziós elektroforézis eredményeit Creutzfeldt-Jakob-kórban szenvedő betegeknél az 1A. és az 1B. ábra mutatja. A legújabb technikai fejlesztések nagyobb felbontást eredményeztek, az eredetileg leírt kettő helyett hat foltot (a 130-as és 131-es fehérjéknek megfelelően). Annak érdekében, hogy megtaláljuk e fehérjék bőséges forrását, megvizsgáltuk a normál agyszövetet, hogy megállapítsuk, található-e agyi fehérje a 130-as és 131-es cerebrospinális folyadék fehérjéinek megfelelő foltkonstelláció közelében. Az 1C. ábra a normál agyi fehérjék kétdimenziós elektroforézisét követő ezüsttel festett gél egy régióját mutatja. Számos fehérje ugyanazon a területen jelenik meg, mint a 130-131-es konstelláció, köztük két olyan, amelynek töltése és tömege megegyezik az agy-gerincvelői folyadék 130-131-es konstellációjával. A két folt helyzetük alapján történő azonosítását komigrációs vizsgálatokkal megerősítették. A 130-as foltot szűk kétdimenziós elektroforézissel tisztítottuk (pH-tartomány, 4,5-5,4), amint az az 1D ábrán látható.
A 130-as foltot 10 blotból kivágtuk, enzimatikusan feltártuk és mikroszekvenáltuk. Négy peptidfragmentumból nyertünk aminosav-szekvenciákat. E szekvenciák közül három, Val-Thr-Glu-Leu-Asn-Glu-Pro-Leu-Xaa-Asn-Glu-Asp-Xaa-Asn-Leu-Leu-Ser-Val-Ala, Asp-Tyr-Tyr-Xaa-Tyr-Leu-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Gly-Glu-Lys és Asn-Val-Val-Val-Xaa-Ala-Arg-Arg-Ser-Ser-Ser-Xaa-Arg-Val-Ile-Ser-Ser-Ser-Ile-Glu-Gln, megegyezett az emberi 14-3-3 fehérje eta izoformájának szekvenciájával. A negyedik szekvencia, Tyr-Ser-Glu-Ala-Xaa-Glu-Ile-Ser, megfelelt a szarvasmarha 14-3-3 fehérje gamma izoformájának.
A 14-3-3 antitest specifikusan reagált a 130 és 131 cerebrospinalis folyadék fehérjékkel egy kétdimenziós elektroforetikus immunobloton, de nem reagált más cerebrospinalis folyadék fehérjékkel, így igazolta, hogy a 130 és 131 cerebrospinalis folyadék fehérjék 14-3-3 fehérjék.
14-3-3 Immunoassay
2. ábra.
2. ábra. Anti-14-3-3β poliklonális nyúl antitest immunfestése nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid-gélelektroforézis után.
Az 1. sáv egy Alzheimer-kór patológiai bizonyítékával rendelkező beteg agy-gerincvelői folyadékát, a 2. és 3. sáv két Creutzfeldt-Jakob-kórban szenvedő beteg agy-gerincvelői folyadékát, a 4. sáv egy normális tehén agy-gerincvelői folyadékát, az 5. sáv egy kísérletileg kiváltott fertőző nyérc-encephalopathiával és a szivacsos betegség patológiai bizonyítékával rendelkező tehén agy-gerincvelői folyadékát mutatja, a 6. sáv normál emberi szérumot, a 7. sáv Creutzfeldt-Jakob-kórban szenvedő beteg szérumát, a 8. sáv normál emberi agy kivonatát, a 9. sáv pedig Creutzfeldt-Jakob-kórban szenvedő beteg agyából származó tisztított prionfehérjét mutatja.
Az a felfedezés, hogy az agy-gerincvelői folyadék 30 kd foltjai (130-as és 131-es fehérjék) 14-3-3 fehérjék, egy egyszerű immunpróba kifejlesztéséhez vezetett, amely segíti a fertőző szivacsos agyvelőbántalom diagnózisát. Amint a 2. ábra mutatja, a Creutzfeldt-Jakob-kórban szenvedő betegek cerebrospinalis folyadékában egy 30 kd immunreaktív sávot találtak (2. és 3. sáv), míg egészséges kontrollok cerebrospinalis folyadékában (az adatok nem láthatóak) vagy egy Alzheimer-kóros betegben (1. sáv) nem mutattak ki ilyen sávot. A várakozásoknak megfelelően a 14-3-3 bőséges volt a normál emberi agy kivonatában (8. sáv). 14-3-3 fehérje nem volt kimutatható a normál szérumban (6. sáv); azonban a Creutzfeldt-Jakob-kórban szenvedő betegek szérumában sem volt kimutatható (7. sáv). A Creutzfeldt-Jakob-kórban szenvedő beteg agyából tisztított prionfehérje (9. sáv) nem mutatott keresztreakciót a 14-3-3 antitesttel, ami megerősítette, hogy a 14-3-3-3 nem prionfehérje.
1. táblázat.
1. táblázat. A 14-3-3-3 immunoassay-vel értékelt agy-gerincvelői folyadékminták a diagnózis szerint. 2. táblázat.
2. táblázat. A 14-3-3 immunoassay érzékenysége és specificitása a Creutzfeldt-Jakob-kór esetében.
A Creutzfeldt-Jakob-kórban szenvedő betegek 71 cerebrospinális folyadékmintájából 68 (96 százalék) volt pozitív 14-3-3-ra (1. táblázat és 2. táblázat). Az egyéb demenciával járó betegségben szenvedő betegek 94 mintájából négy (4 százalék) volt pozitív 14-3-3-ra (1. táblázat és 2. táblázat) (P<0,001). Továbbá, amikor a demenciában szenvedő betegeket, akikről ismert volt, hogy a vizsgálatot megelőző egy hónapon belül akut agyi infarktuson estek át, kizárták az elemzésből, 91 mintából csak 1 (1 százalék) volt pozitív (P<0,001). A vizsgálatot megelőző egy hónapban több infarktusos demenciában szenvedő, de stroke-ot nem kapott mind a 10 beteg mintái negatívak voltak 14-3-3-ra. A többi demenciában szenvedő beteg agy-gerincvelői folyadékmintái közül az egyetlen hamis pozitív eredmény egy olyan betegtől származott, akinek klinikai diagnózisa Alzheimer-kór volt, amit patológiai vizsgálatokkal nem igazoltak.
A 14-3-3 a demenciával nem járó egyéb neurológiai betegségben szenvedő betegek 66 agy-gerincvelői folyadékmintájából 18-ban (27 százalék) mutatták ki. A 18 pozitív minta akut vírusos agyvelőgyulladásban, a vizsgálatot megelőző egy hónapon belüli stroke-ban (demencia nélkül), subarachnoidalis vérzésben vagy Rett-szindrómában szenvedő betegektől származott. A Creutzfeldt-Jakob-kór ésszerűen nem szerepelhetett ezen betegségek egyikének differenciáldiagnózisában sem.
Összességében a 14-3-3 immunpróba mint a Creutzfeldt-Jakob-kór markere érzékenysége 96 százalék volt (68 valódi pozitív eredmény osztva 71 valódi pozitív és hamis negatív eredménnyel; 95 százalékos konfidenciaintervallum, 92-99 százalék), a specificitás pedig 88 százalék (164 valódi negatív eredmény osztva 186 valódi negatív és hamis pozitív eredménnyel; 95 százalékos konfidenciaintervallum, 84-92 százalék). Ennél is fontosabb, hogy a demenciában szenvedő összes beteg esetében a vizsgálat specificitása 96 százalékos volt (90 igaz negatív eredmény osztva 94 igaz negatív és hamis pozitív eredménnyel; 95 százalékos konfidenciaintervallum, 90-96 százalék), és amikor a vizsgálatot megelőző egy hónapon belül demenciában és agyi infarktusban szenvedő három beteget kizárták, az immunpróba specificitása 99 százalékos volt (90 igaz negatív eredmény osztva 91 igaz negatív és hamis pozitív eredménnyel; 95 százalékos konfidenciaintervallum, 97-100 százalék) (1. és 2. táblázat).
A kétdimenziós elektroforézis és az immunoassay összehasonlítása
3. táblázat.
3. táblázat. A 130 és 131 fehérjék kétdimenziós elektroforézisének és a 14-3-3 immunoassay összehasonlítása.
Összehasonlítottuk a 130 és 131 fehérjék kétdimenziós elektroforézisét a 14-3-3 immunoassay-vel 50 cerebrospinális folyadékmintában (3. táblázat). A Creutzfeldt-Jakob-kórban szenvedő betegek 15 mintájából 13 pozitív volt mindkét teszttel, a másik 2 minta pedig negatív volt a 130-as és 131-es fehérjékre, de pozitív a 14-3-3 fehérjére. A két teszt eredményei megegyeztek a Creutzfeldt-Jakob-kórral vagy más neurológiai rendellenességgel nem társuló demenciában szenvedő betegek mintáiban. Bár a két teszt specificitása hasonló, a 14-3-3 immunoassay valamivel nagyobb érzékenységgel rendelkezik.
14-3-3 Immunoassay in Animals
4. táblázat.
4. táblázat. A 14-3-3 immunoassay eredményei állatokból származó agy-gerincvelői folyadékmintákban.
Az állatokon végzett vizsgálatok eredményei összhangban voltak az embereken végzett vizsgálatok eredményeivel. A 2. ábra egy normál tehénből (4. sáv) és egy fertőző szivacsos agyvelőbántalom patológiai bizonyítékával rendelkező tehénből (5. sáv) származó cerebrospinalis folyadékban végzett vizsgálat eredményeit mutatja. Amint a 4. táblázat mutatja, a 14-3-3 fehérje kimutatható volt kilenc kísérletileg kiváltott fertőző nyérc-encephalopathiában vagy súrlókórban szenvedő szarvasmarha közül hatnak az agy-gerincvelői folyadékában. A klinikai tüneteket mutató, de a fertőző szivacsos agyvelőbántalom patológiai bizonyítékait nem mutató tehén tesztje szintén pozitív volt. Egyetlen kontrollszarvasmarhának sem volt pozitív a tesztje. A természetes úton szerzett surlókórban szenvedő hat juh közül ötnél a teszt pozitív volt, az egy kontrolljuhnál pedig negatív. Mind a 15 kísérletileg fertőzött csimpánz tesztje pozitív volt, míg a 77 kontrollcsimpánz közül egyiké sem. A 14-3-3 immunpróba általános érzékenysége az állatokban 87 százalékos, az általános specificitás pedig 99 százalékos volt.