Mind a denaturált, mind a natív BR képes kötődni a GroEL-hez
A GroEL aktivitásának mechanizmusában központi szerepet játszik az a képessége, hogy a polipeptidek széles skáláját képes felismerni, elsősorban a szubsztrát hidrofób maradékai és a GroEL apikális doménjének H és I hélixei közötti kölcsönhatások révén (1A ábra) (Coyle et al. 1997). Itt először a denaturált és a natív BR GroEL-hez való kötődését vizsgáltuk izotermikus titrációs kalorimetriával (ITC), mivel mindkét állapot bőséges hidrofób felületi maradékokkal rendelkezik, amelyek könnyen hozzáférhetőek a GroEL számára. Amint a 2A. ábrán látható, a GroEL BR-rel történő titrálása mindkét esetben exoterm titrációs termogramot eredményez. A hőváltozások specifikusan a BR GroEL-hez való kötődésének köszönhetőek, mivel a BR egymás utáni injektálása a chaperonin nélküli vizsgálati pufferekbe lapos termogramokat eredményez (kiegészítő S1. ábra). A 2A. ábrán látható egyes injektálások hőjét integráltuk, korrigáltuk a hígítási hővel, és ábrázoltuk a BR: GroEL moláris arányával szemben (2B. ábra). A hőváltozás illeszkedik az egyik helymegkötési modellhez (piros és kék görbék), ami a denaturált BR esetében 0,3 nmol/L közeli, a natív BR esetében pedig 6,0 nmol/L közeli disszociációs állandót (Kd) eredményez (1. táblázat). A BR denaturálása tehát egy nagyságrenddel növelte a GroEL kötési affinitását ehhez a membránfehérjéhez. Másrészt mindkét BR minta kötődését kedvező entalpiaváltozás (ΔH) hajtja és negatív entrópiaváltozás (ΔS) áll szemben; a mindkét esetben meghatározott kötési sztöchiometria (N) közel egységnyi (1. táblázat). A natív BR kötődése azonban egyértelműen kevésbé entalpiás, kisebb entrópia-kompenzációval.
BR kötődése a GroEL-hez ITC-vel értékelve. A GroEL titrálása SDS-denaturált BR-rel (dBR, piros) vagy natív BR-rel (nBR. kék). A termogramokat 20 °C-on rögzítettük MicroCal ITC200 műszerrel. B Az A-ban szereplő egyes injektálások hőcseréjét integráltuk és ábrázoltuk a BR:GroEL moláris arány függvényében. A szolid vonalak az adatok illesztését jelentik egyetlen helykészlet modelljéhez (minden hely azonos és egyenértékű), a kapott termodinamikai paramétereket pedig az 1. táblázat tartalmazza
A fedő alakú ko-chaperonin GroES a baktériumokban a GroEL által közvetített fehérje hajtogatás alapvető összetevője, és kimutatták, hogy a GroEL-en ugyanazokat a kötőhelyeket használja, mint a szubsztrát (Chen és Sigler 1999). A GroEL denaturált BR-rel történő titrálása GroES jelenlétében azt jelzi, hogy a GroES-nek kevés hatása van a BR-kötésre (kiegészítő S2. ábra és 1. táblázat). Ez az eredmény a Kd figyelembe vételével érthető, amelyet a GroEL/ES komplex kialakulásához korábban 3 μmol/L-nek határoztak meg, és jelentősen magasabb, mint az itt meghatározott BR-GroEL komplexé (Behlke és mtsai. 1997). Ez a két chaperonin fehérje sokkal gyengébb kölcsönhatására utal, és így összhangban van a jelentéktelen hatással. ATP jelenlétében azonban, amely in vivo szabályozza a GroEL és GroES kötődési és felszabadulási ciklusait, a GroEL/ES affinitása három nagyságrenddel megnőne (normál esetben Kd ~1 nmol/L) (Farr et al. 2000), elméletileg képes lenne a BR GroEL-hez való kötődésével konkurálni. Ezt követően megvizsgáltuk az apoGroEL hatását a BR hajtogatására, majd a GroES és az ATP szerepét ebben a folyamatban.
A GroEL-GroES rendszer képes modulálni a BR hajtogatást DDM jelenlétében
Megfigyelték, hogy az SDS-denaturált BR egy része visszahajtogatódott, amikor szolubilizáló detergens n-dodecil-β-D-maltozid (DDM) feleslegével hígították, amint azt a retinális abszorpció helyreállásának mérése kimutatta (kiegészítő S3 ábra) (Booth 1997). A detergens nélküli vagy csak GroEL-lel kiegészített vizsgálati pufferben nem volt kimutatható jelentős visszanyerés. DDM jelenlétében azonban a GroEL hozzáadása nyilvánvaló hatást mutatott a BR hajtogatására (kiegészítő S3. ábra). A GroEL (0,15 μmol/L) által közvetített hajtogatás sebességi állandója, az egy exponenciális kinetikával való illesztéssel értékelve, ~kétszer alacsonyabbnak becsülték, mint a spontán hajtogatást. A GroEL-ről ismert, hogy jellemzően késlelteti az olyan szolubilis fehérjék hajtogatását, amelyek távollétében hatékonyan tudnak hajtogatni. Ezt az intramolekuláris hajtogatás és a GroEL-hez való intermolekuláris kötődés közötti versennyel magyarázták (Gray és Fersht 1993; Itzhaki és mtsai. 1995). Teljesen hihetőnek tűnik, hogy a GroEL hasonlóan viselkedik a denaturált BR visszahajtogatása során. Amikor a GroEL koncentrációját 0,30 μmol/L-re növeltük, a becsült sebességi állandó nem változott nyilvánvalóan, míg a hajtogatás hozama 60 perc után a spontán hajtogatásnál jóval magasabb szintet ért el (kiegészítő S3. ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy az apoGroEL csökkentheti a BR hajtogatási sebességet, de növelheti a hajtogatott fehérje hozamát.
Mivel a bakteriális sejtek több millimol ATP-t tartalmaznak, és normál körülmények között a GroES és a GroEL relatív moláris aránya 1,9, hősokk után pedig 4,7 (Moparthi és mtsai. 2013); a GroEL valószínűleg nem marad sokáig ATP és GroES megkötése nélkül. ATP jelenlétében (kék a 3A. ábrán) a helyesen hajtogatott BR helyreállítása jelentősen gyorsabb és nagyobb volt, mint a csak apoGroEL-lel vagy a spontán folyamattal (piros és fekete a 3A. ábrán). Ezzel szemben a GroEL és a GroES kombinációja kevés hatást mutatott a spontán hajtogatás sebességére, de bizonyos mértékben csökkentette a hozamot (3A. ábra, cián). Ez arra utal, hogy a GroEL és a GroES közötti kölcsönhatás nem igényel ATP-t, amelyet valószínűleg a GroEL-hez kötött BR indukált, ami viszont kedvezőtlenül hatott a helyesen hajtogatott fehérje visszanyerésére. Amikor a teljes chaperonin rendszert használtuk (3A. ábra, zöld), maximális sebességnövekedést tapasztaltunk, de a hajtogatási hozam a két előző eset közé esett.
A BR hajtogatás ATP-függő GroEL-GroES rendszer által modulált időfolyama. A A hajtogatott BR visszanyerését folyamatosan követtük az 554 nm-en mért abszorbanciával. A következő adalékokat végeztük: nincs (fekete); 0,3 μmol/L GroEL (piros); 0,3 μmol/L GroEL és 5 mmol/L ATP (kék); 0,3 μmol/L GroEL és 0,6 μmol/L GroES (cián); 0,3 μmol/L GroEL, 0,6 μmol/L GroES és 5 mmol/L ATP (zöld). B Először a nettó GroEL által közvetített BR hajtogatást végeztük el; majd T = 60 percnél a mintát csak ATP-vel, csak GroES-szel vagy mindkettővel kiegészítettük a jelzetteknek megfelelően. C Az A-val való összehasonlítás érdekében a GroEL nem ciklikus, egygyűrűs (SR1) változatának BR hajtogatásra gyakorolt hatását is elemeztük. Az SR1, GroES és ATP koncentrációja 0,6 μmol/L, 1,2 μmol/L, illetve 5 mmol/L volt. D A GroEL/ES plusz ATP hatását a BR natív hajtogatására úgy vizsgáltuk, hogy az abszorbancia változását követtük 560 nm-en. A B-ben és D-ben használt chaperonin és nukleotid koncentrációk megegyeztek az A-ban használtakkal. A BR-t minden kísérletben 2,4 μmol/L-en tartottuk. A kék és zöld vonalak A-ban és a kék vonal C-ben az adatok háromfázisú exponenciális egyenlethez való illesztését, míg a többi vonal az egyfázisú exponenciális egyenlethez való illesztést jelenti. A B-ben és D-ben szereplő vonalak mindegyike egyszerű szemléltető
A fenti eredmények arra utalnak, hogy az ATP és a GroES eltérő módon befolyásolhatja a GroEL által közvetített BR hajtogatást. A GroES GroEL-hez való kötődése némileg károsan hat a hajtogatásra, ellentétben a szubsztrát GroEL/ES ketrecbe záródásának jól ismert pozitív szerepével a támogatott hajtogatásban (Jewett és Shea 2010). Ezután feltettük a kérdést, hogy hogyan jön létre ez a káros hatás. Érdekes módon a GroES önmagában vagy annak mobil hurokszekvenciája, amelyen keresztül a GroES a GroEL-hez kötődik, szintén elősegítette a hajtogatott BR visszanyerését (kiegészítő ábra S4). Sőt, a hurokszekvencia a GroES-hez hasonló hatást mutatott a GroEL által közvetített hajtogatásban ATP hiányában és jelenlétében (kiegészítő ábra S4). Bár a GroES-hez hasonlóan nem tud zárt sapkát képezni a GroEL központi ürege felett, ami arra utal, hogy a hurok-GroEL kölcsönhatás jelentősen hozzájárul a hajtogatáshoz. Figyelemre méltó, hogy a GroEL apikális felületén a GroES mobil hurok kötésében részt vevő hidrofób maradékok többnyire átfedésben vannak a szubsztrátfehérje kötésében részt vevő maradékokkal (Motojima és mtsai. 2000). Nem valószínű, hogy a hidrofób BR-t a mobil hurok kiszorította és felszabadította a hidrofil GroEL/ES ketrecbe, különösen, ha figyelembe vesszük a ketrecen kívüli DDM micellák jelenlétét, ami tovább kedvezne a BR hajtogatásának vagy szolubilizációjának. Lehetőleg, ahogyan azt számos szolubilis fehérje asszisztált hajtogatásánál kimutatták (Motojima és Yoshida 2010), a BR a GroEL/ES határfelület közelében fogható be, részben kifelé nyúlva, amikor a teljes rendszert vagy akár csak a GroEL/ES-t használták ebben a vizsgálatban. Egy ilyen kölcsönhatás megakadályozhatja, hogy a BR hozzáférjen a kedvező DDM-micellákhoz, ami a GroES és a mobil hurok esetében is megfigyelt csökkent hajtogatási hozamot eredményezi.
Egyes vizsgálatok szerint azonban az ATP és a GroES szerepe csak a ragacsos szubsztrátok disszociációjában áll (azaz az itt meghatározott nmol/L tartományban lévő Kd-vel), amelyek korlátozzák a támogatott hajtogatás sebességét, vagy akár gátolják a GroEL hajtogatási aktivitását, ha nem távolítják el (Priya et al. 2013). Annak tesztelésére, hogy a GroES és az ATP hasonló hatást mutat-e a BR asszisztált hajtogatásában, először 60 percig inkubáltuk az apoGroEL-t denaturált BR-rel; majd GroEL-t vagy/és ATP-t adtunk hozzá (3B ábra). Bármelyik komponens későbbi hozzáadása tovább elősegítette a BR hajtogatást, de kevésbé volt hatékony, mint a kettő egyidejű hozzáadása, ami a kettő közötti szinergizmust bizonyítja a GroEL által közvetített hajtogatás segítésében. A BR transzmembrán peptidekkel végzett anizotrópia mérések, amelyeket a denaturált BR mimetikumaként használtunk, hogy megkerüljük a denaturált BR és a GroEL-BR kölcsönhatások dinamikus természete által okozott bonyodalmakat, azt mutatták, hogy csak az ATP és a GroES kombinációja volt képes hatékonyan szétválasztani az előformált peptid-GroEL komplexet (kiegészítő ábra S5). Úgy tűnik tehát, hogy mind a GroES, mind az ATP szükséges a nagy affinitású BR-konformerek disszociációjához és a megrekedt GroEL-kötő (vagy katalitikus) helyek regenerációjához.
A GroES és az ATP GroEL által közvetített BR-feldolgozásra gyakorolt hatásának további vizsgálatához egy egygyűrűs GroEL-mutánst (SR1) használtunk, amely a ciklikus GroEL-GroES rendszerrel ellentétben stabil komplexet alkot a GroES-szel (Weissman et al. 1995). A GroEL-lel végzett megfigyelésünkhöz hasonlóan az ATP növelte az SR1 által közvetített hajtogatás sebességét és hozamát (kék a 3C. ábrán), míg a GroES jelenléte mindkét szempontot jelentősen csökkentette (cián) az egyedül apoSR1-gyel vagy a spontán folyamattal (piros vagy fekete) összehasonlítva. Mivel ITC-vel megállapítottuk, hogy a denaturált BR közel egységnyi sztöchiometriával kötődik az SR1-hez (kiegészítő S2. ábra), és az alkalmazott SR1 koncentrációja kétszerese volt a GroEL-nek, feltételezzük, hogy több BR-SR1 komplex képződött, mint BR-GroEL, ezáltal a GroES nagyobb hatást gyakorolt a hajtogatásra (cián). A várakozásoknak megfelelően mind az ATP, mind a GroES hozzáadása jelentéktelen hatást mutatott a BR visszaalakítására (zöld), ami a GroES SR1-hez való irreverzibilis kötődésének tulajdonítható ATP jelenlétében (Weissman és mtsai. 1995). Továbbá ez az eredmény azt jelzi, hogy a GroEL esetében megfigyelt maximális sebességnövekedés a GroES kötődésének és felszabadulásának ATP által szabályozott többszörös ciklusainak köszönhető.
A GroEL önmagában vagy ATP-vel vagy/és GroES-szel kombinálva elhanyagolható hatást mutatott a DDM-mel szolubilizált natív BR szerkezetére (3D ábra), ami arra utal, hogy a natív fehérjén belüli intramolekuláris kölcsönhatás erősebb, mint a GroEL intermolekuláris kötődése. Így a BR chaperonin által közvetített átmenete a metastabil denaturált állapotból a natív állapotba termodinamikailag kedvező.
A chaperonin által közvetített dezaggregáció és a kibontakozás egyaránt bizonyított
A BR spontán hajtogatásának mérése különböző koncentrációk mellett azt mutatja, hogy az aggregáció csak részben eredményezte a helyesen hajtogatott BR helyreállítását, és a látszólagos sebesség koncentrációfüggetlen volt, ami arra utal, hogy az aggregáció irreverzibilis (kiegészítő S6. ábra). A szolubilizáló detergens DDM hiányában az SDS-denaturált BR diffúziós együtthatója (~67 μm2/s) fluoreszcens korrelációs spektroszkópiával (FCS) jóval alacsonyabb volt, mint a GroEL-hez kötötté (~104 μm2/s) (4. ábra). Ez azt tükrözi, hogy a denaturált BR által képzett aggregátumok még nagyobbak, mint az ITC-vel meghatározott, egységhez közeli kötési sztöchiometriájú BR-GroEL komplex. Ez azt is jelenti, hogy a GroEL képes volt megbontani az aggregációs struktúrát, lényegében a monomer BR-rel pumpálva a produktív hajtogatási utat. Továbbá a DDM-mel szolubilizált nBR diffúziós együtthatója ~117 μm2/s volt, ami nagyobb, mint a dBR-é GroEL-lel, és sokkal nagyobb, mint a dBR-é önmagában (4. ábra). Ez arra utal, hogy az nBR jól diszpergálódott DDM jelenlétében, és alátámasztja a dBR GroEL által közvetített dezaggregációjának elképzelését is. Emellett, amikor a teljes chaperonin rendszert adtuk a denaturált BR-hez, azonnal fehér flokkulens csapadék volt látható (az adatok nem láthatóak), ami a kényszerített kibontakozásra, valamint a GroES és az ATP közötti szinergizmusra utal ebből a szempontból. Szolubilizáló detergensek vagy biológiai membránokat utánzó lipidek nélkül az ömlesztett oldatban a fel nem hajtogatott BR azonnal aggregálódna és kicsapódna, ellentétben a DDM jelenlétében megfigyelt jelentős hajtogatási sebességnövekedéssel.
FCS mérés a denaturált BR-en GroEL hiányában vagy jelenlétében a natív BR-hez képest. Az Alexa Fluor 488 fluoreszcencia G(τ) fluoreszcencia autokorrelációs amplitúdóit mutattuk SDS-denaturált BR önmagában vagy GroEL többlettel szolubilizáló detergens hiányában, illetve DDM-mel szolubilizált natív BR esetében. A diffúziós együtthatókat (D) az autokorrelációs görbe 1. egyenlet szerinti illesztésével kaptuk. A standard eltérések három független mérésből származnak
A BR GroEL-GroES által közvetített membránbeépülése
Hogy meghatározzuk, hogy a GroEL-GroES támogatja-e vagy hogyan támogatja a BR beépülését a kettősrétegbe, fordított citoplazmatikus membránvizikulákat (IMV) készítettünk Escherichia-ból. coli sejtekből, és denaturált BR-rel kevertük össze apoGroEL jelenlétében és hiányában, illetve ATP/GroES mellett (5A. ábra). Az ApoGroEL jelentéktelen változást okozott a helyesen összehajtott BR visszanyerésében az IMV-kben, amint azt UV-Vis spektroszkópiával mértük (fekete és piros). A DDM-micellákban történő visszahajtástól eltérően a GroEL és az ATP hozzáadása károsnak bizonyult a membránbeépülésre (kék), míg a GroEL GroES-szel kombinálva elősegítette ezt a folyamatot (ciánkék). Ennek a reprodukálható különbségnek a valódi oka nem ismert, de az IMV-k merevsége és a GroEL-hez kötött BR ATP vagy GroES kötés által indukált szerkezeti változása lehetséges okok lehetnek. Konkrétan a GroEL által történő ATP-kötésről ismert, hogy a chaperonin üregébe nyíló nyílás kitágulását okozza (Skjaerven és mtsai. 2015). Ez a változás nagyobb mértékű, mint amit pusztán a GroES GroEL-hez való kötődése okoz (Kim et al. 2005), így valószínűleg lehetővé teszi a kötött szubsztrát kibontakozását (Lin et al. 2008; Sharma et al. 2008), ami megfelelő oldószerben kedvező a produktív hajtogatáshoz. A nagy dinamikájú DDM-micellákkal ellentétben azonban az IMV-k valószínűleg nem voltak képesek azonnal megvédeni a kibontott BR-fajtákat, és időben kedvező hajtogatási mikrokörnyezetet biztosítani. Ehhez képest a GroES gyenge asszociációja a GroEL-lel ATP hiányában talán hatékonyabban juttatja el a BR-t az előállított IMV-kbe. A DDM-micellákban történő visszahajtogatáshoz hasonlóan azonban a teljes GroEL-GroES rendszer nagymértékben fokozta a BR membránbeépülését (zöld), amely gyorsan elérte a stabil állapotot, a visszanyert BR mennyisége pedig a két előző eset közé esett.
A BR beillesztése az IMV-kbe a GroEL-GroES rendszer által közvetítve. A A denaturált BR (2,4 μmol/L) IMV-kbe történő beillesztését és/vagy visszaalakítását folyamatosan követtük az 554 nm-en mért abszorbanciával. A következő adalékokat végeztük: nincs (fekete); 0,3 μmol/L GroEL (piros); 0,3 μmol/L GroEL és 5 mmol/L ATP (kék); 0,3 μmol/L GroEL és 0,6 μmol/L GroES (cián); 0,3 μmol/L GroEL, 0,6 μmol/L GroES és 5 mmol/L ATP (zöld). B A natív BR hatékonyan átvihető az IMV-kre GroEL jelenlétében ATP és GroES segítségével. A natív BR, GroEL, GroES, GroES és ATP vizsgált koncentrációi 0,4, 5, 10 μmol/L, illetve 5 mmol/L voltak
A következőkben a fluoreszcens anizotrópia segítségével vizsgáltuk a bakteriális chaperoninok hatását a BR IMV-kbe történő beillesztésére (5B ábra). Amikor fluoreszcensen jelölt natív BR-t kevertünk túlzott mennyiségű GroEL-lel, az anizotrópia magasabb értékre tolódott, ami azt bizonyította, hogy a membránfehérje stabil komplexet alkotott a chaperoninnal. Fontos, hogy az IMV-k későbbi hozzáadása az anizotrópia további növekedéséhez vezetett, ami a BR IMV-kbe való integrálódására utal. Az ATP és a GroES tovább fokozta a BR membránba való bejutását, amit szintén az anizotrópia növekedése alapján ítéltek meg. Ezek az eredmények felvetik annak lehetőségét, hogy a GroEL-nek a GroES-szel és az ATP-vel együtt közvetlen szerepe lehet a fehérjék in vivo lipid kettősrétegbe történő integrációjában.