Abstract
A glikogén-foszforiláz az izom szénhidrát-anyagcsere fontos enzimje. Szervetlen foszfátot használ fel a glükóz eltávolítására a glikogénből, glükóz-1-foszfátot termelve, amely ATP előállítására használható. Az inaktív glikogén-foszforiláz (foszforiláz h) vagy az 5′-AMP alloszterikus kötődése, vagy a foszforiláz-kináz (PhK) általi foszforiláció révén aktiválódik. A foszforiláció során foszforiláz a keletkezik, amely AMP hiányában is aktív. A PhK az egyetlen kináz, amely képes foszforilálni a foszforiláz b-t, amely viszont a PhK egyetlen szubsztrátja. Ez a disszertációs kutatás megkísérelte meghatározni ennek a specifitásnak az okait és azt, hogy ez a két enzim hogyan ismeri fel egymást, a glikogén-foszforiláz helyileg irányított mutánsainak vizsgálatával;Minden mutánst a foszforiláz-kináz katalitikus alegysége, a gamma(1–300) csonka formájával való kölcsönhatásuk változására vizsgáltunk. Három mutáció (R69K, R69E és E501A), amelyeket a b vagy a foszforiláz aminoterminusával kölcsönhatásba lépő helyeken végeztünk, a gamma(1–300) és a b foszforiláz foszforilációjában alig mutattak különbséget. Öt, a foszforiláz amino-terminális farkában lévő három helyen végzett mutáció (K11A, K11E, I13G, R16A és R16E) azonban a gamma(1–300) katalitikus hatékonyságának csökkenését eredményezte a b foszforilázhoz képest. Az R16E volt a gamma(1–300) legrosszabb szubsztrátja, 47-szeres katalitikus hatékonyságcsökkenést eredményezve. Az amino-terminus és különösen az Arg 16 nagyon fontos tényező a foszforiláz gamma(1–300) általi felismerésében. Ezenkívül az I13G és az R16A képes volt foszforilálni a protein kináz A által, amely nem ismeri fel a natív foszforilázt;A mutánsok némelyikének megváltozott konformációs állapota is megfigyelhető volt. Az R16A és az R16E nagyon alacsony AMP-koncentrációnál aktiválódott és alacsony hőmérsékleten kristályosodott, mint a foszforiláz a. Ez azt jelzi, hogy foszforiláció nélkül is inkább hasonlít a szerkezetük a foszforiláz a-ra, mint a foszforiláz b-re. Két másik mutáns éppen ellenkező hatást váltott ki, foszforiláció után úgy viselkedtek, mint a foszforiláz b. A mutánsok a foszforilációt követően a foszforiláz b-re hasonlítottak. Az R69E csak részben aktiválódott foszforiláció hatására, az I13G pedig teljesen inaktív volt foszforiláció után. Az I13G volt az első olyan foszforiláz forma megfigyelése, amely foszforilációval nem volt aktiválható.