H-D cserét eredetileg a hidrogéncsere atyja, Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang mérte sűrűséggradiens csövek segítségével. A modern korban a H-D cserét elsősorban a módszerekkel figyelték meg: NMR-spektroszkópia, tömegspektrometria és neutronkristallográfia. Mindegyik módszernek megvannak az előnyei és hátrányai.
NMR-spektroszkópiaSzerkesztés
A hidrogén és deutérium atommagok mágneses tulajdonságai nagymértékben különböznek egymástól. Így NMR-spektroszkópiával meg lehet különböztetni őket. A deuteronok nem figyelhetők meg az 1H NMR spektrumban, és fordítva, a protonok nem figyelhetők meg a 2H NMR spektrumban. Ha egy erősen deuterált minta 1H NMR-spektrumában kis jelek figyelhetők meg, ezeket maradék jeleknek nevezzük. Ezek felhasználhatók a molekula deuteráltsági szintjének kiszámítására. A 2H NMR-spektrumokban nem figyelhetők meg hasonló jelek, mivel ez a technika az 1H-analízishez képest alacsony érzékenységű. A deuteronok jellemzően nagyon hasonló kémiai eltolódást mutatnak, mint az analóg protonok. A 13C NMR-spektroszkópiával történő elemzés is lehetséges: a hidrogén (1/2) és a deutérium (1) eltérő spinértékei különböző hasadási szorzatokat eredményeznek. NMR-spektroszkópiával meghatározható a molekulák helyspecifikus deuteráltsága.
Egy másik módszer a HSQC-spektrumokat használja. A HSQC-spektrumokat jellemzően egy sor időpillanatban rögzítik, miközben a hidrogén kicserélődik a deutériummal. Mivel a HSQC-kísérlet specifikus a hidrogénre, a jel exponenciálisan csökken, ahogy a hidrogén kicserélődik. Ezután lehetséges egy exponenciális függvényt illeszteni az adatokhoz, és így megkapjuk a csereállandót. Ez a módszer egyszerre ad maradékspecifikus információt a fehérje összes maradékára vonatkozóan A fő hátránya, hogy a spektrum előzetes hozzárendelését igényli a kérdéses fehérjéhez. Ez nagyon munkaigényes lehet, és általában 25 kDa-nál kisebb fehérjékre korlátozza a módszert. Mivel a HSQC-spektrum felvétele percektől órákig tart, a gyorsan cserélődő amidokat más impulzussorozatokkal kell mérni.
TömegspektrometriaSzerkesztés
A hidrogén-deutériumcsere tömegspektrometria segítségével meghatározható a H/D-cserén átesett molekulák teljes deutériumtartalma. A szükséges mintaelőkészítés miatt általában úgy tekintik, hogy csak a nem cserélhető hidrogénatomok pontos mérését biztosítja. Ez magában foglalhatja a gázfázisban történő H/D-cserét vagy az ionizációt megelőző oldatfázisú cserét is. Az NMR-spektroszkópiában számos előnye van a H-D csere reakciók elemzésével szemben: sokkal kevesebb anyagra van szükség, a mintakoncentráció nagyon alacsony lehet (akár 0,1 uM), a mérethatár sokkal nagyobb, és az adatok általában sokkal gyorsabban gyűjthetők és értelmezhetők.
A deutérium atommag kétszer olyan nehéz, mint a hidrogén atommag, mivel a proton mellett egy neutront is tartalmaz. Így egy olyan molekula, amely tartalmaz némi deutériumot, nehezebb lesz, mint egy olyan, amely csak hidrogént tartalmaz. Ahogy egy fehérje egyre inkább deuterálódik, a molekulatömeg ennek megfelelően növekszik. A fehérje tömegében a deuterálás hatására bekövetkező változás kimutatását a modern fehérje tömegspektrometria tette lehetővé, amelyről először 1991-ben Katta és Chait számolt be.
A helyspecifikus deuteráció meghatározása tömegspektrometriával bonyolultabb, mint NMR spektroszkópiával. Például a deutériumcsere helye és relatív mennyisége a peptidgerinc mentén nagyjából meghatározható, ha a fehérjét proteolízisnek vetjük alá a cserereakció kioltása után. Az egyes peptideket ezután elemezzük az egyes peptidfragmentumok teljes deutériumtartalmát. Ezzel a technikával a deutériumcsere felbontását az emésztés során keletkező peptidek mérete határozza meg. A proteolízishez általában savas proteázt, pepszint használnak, mivel a fojtási pH-t a proteolitikus reakció során fenn kell tartani. A visszaváltás minimalizálása érdekében a proteolízist és az azt követő tömegspektrometriás elemzést a lehető leggyorsabban kell elvégezni. A peptikus emésztés HPLC-szeparációját gyakran alacsony hőmérsékleten végzik közvetlenül az elektrospray tömegspektrometria előtt, hogy minimalizálják a visszacserét. Újabban az UPLC-t használják a jobb elválasztási képességek miatt.
1999-ben javasolták, hogy a deuterált peptidek ütközés-indukált disszociációval (CID) történő fragmentációjával és a tandem tömegspektrometriával együtt lehetséges az egy-hideg felbontás elérése. Hamarosan kiderült, hogy a CID a peptideken belül a deutérium pozíciójának “összekeveredését” okozza. A MALDI in-source decay (ISD), az elektronbefogási disszociáció (ECD) és az elektronátadási disszociáció (ETD) által létrehozott fragmentáció azonban megfelelő kísérleti körülmények között kevéssé vagy egyáltalán nem zavarosodik. Az izotópjelölés zavarosodását az ion disszociációját megelőző ütközéses melegedés okozza, és míg a CID zavarosodást okoz, az ütközéses melegedés az ionizáció és az iontranszport során is előfordulhat. Az ionfűtést okozó műszerparaméterek gondos optimalizálásával azonban a hidrogén zavarosodás olyan mértékben minimalizálható, hogy az oldatfázisú izotópos jelölés megmaradjon, amíg a fragmentálást olyan technikával lehet elvégezni, ahol zavarosodás nem fordul elő. Újabban az ultraibolya fotodiszszociációt (UVPD) is vizsgálták, mint lehetséges fragmentációs technikát a deutérium peptideken és fehérjéken belüli lokalizálására. E tekintetben a következtetések vegyesek: míg bizonyos körülmények között lehetséges olyan UVPD-fragmentumokat kapni, amelyek nem mentek át scramblingen, mások kimutatták, hogy scrambling mind a peptidek, mind a fehérjék esetében előfordulhat magának az UVPD-fragmentációs lépésnek a során. A jelenlegi elmélet, amely ezeket a látszólagos ellentmondásokat konszolidálja, a peptidek és fehérjék UV-sugárzása során fellépő kettős fragmentációs útvonalhoz, azaz a közvetlen és a statisztikai disszociációhoz kapcsolódik. Azaz, ha a kísérleti körülmények a közvetlen disszociációnak kedveznek, és a prekurzoriont a fragmentáció előtt és közben alacsony belső energiákon tartják, akkor a keletkező fragmentumok deutériumszintje a nem-szkanderezett prekurzornak fog megfelelni. A kísérleti körülmények azonban kedvezhetnek a statisztikai disszociációnak az UV-sugárzás során, különösen hosszú besugárzási idő és alacsony gáznyomás esetén, ami az UV-fotonok által hozzáadott elektronikus gerjesztési energia belső átalakulásához vezet. Az eredmény a besugárzott molekula rezgésgerjesztése, amely viszont zavarosodáson megy keresztül.
NeutronkrisztallográfiaSzerkesztés
A gyorsan cserélődő fajok (pl. hidroxilcsoportok) hidrogén-deutérium cseréje neutronkrisztallográfiával atomi felbontásban kvantitatív módon mérhető, mégpedig valós időben, ha a csere a diffrakciós kísérlet során történik.
A nagy intenzitású neutronsugarakat általában spallációval állítják elő linák részecskegyorsítókban, például a Spallációs Neutronforrásban. A neutronok a röntgensugárzáshoz hasonlóan diffraktálják a kristályokat, és szerkezeti meghatározásra használhatók. A biológiai környezetben egy és nulla elektron közötti elektronokkal rendelkező hidrogénatomok gyengén törik meg a röntgensugarakat, és normál kísérleti körülmények között gyakorlatilag láthatatlanok. A neutronok az atommagokról szóródnak, és ezért képesek a hidrogén- és deutériumatomok kimutatására.
A hidrogénatomokat rutinszerűen deutériummal helyettesítik, ami erős és pozitív szórási tényezőt vezet be. Gyakran elegendő, ha egy fehérjekristályban gőzdiffúzióval csak az oldószer és a labilis hidrogénatomokat cseréljük ki. Egy ilyen szerkezetben a kicserélhető deutérium atomok foglaltsága a kristályban 0-100% között finomodik, ami közvetlenül számszerűsíti a csere mennyiségét.