Eredmények
A jelölt GATA-1 hatékony biotiniilálása transzfektált sejtekben. A jelölt fehérjék specifikus in vivo biotiniilálásának sémáját emlőssejtekben az 1A. ábra vázolja. Az eljárás szerint egy kis (23 aa) peptidcímkét fuzionálunk a kívánt fehérjéhez, és a BirA, egy bakteriális fehérje-biotin ligázzal (20) együtt expresszáljuk a sejtekben. A felhasznált peptidcímkét korábban egy szintetikus peptidkönyvtárból izolálták, amelyet a BirA által közvetített biotiniilációra vizsgáltak, amely specifikusan a címke lizin-maradékánál történik (16). A fehérje adatbázisokban végzett keresések nem azonosítottak olyan természetesen előforduló fehérjét, amely a peptidcímkéhez hasonló szekvencia motívummal rendelkezne.
(A) A jelölt GATA-1 BirA biotin-ligáz általi specifikus biotinilálásának sémája MEL sejtekben. A GATA-1 N-terminusához fuzionált 23-aa peptid tag szekvenciája látható. A csillag jelzi azt a lizin-maradékot, amelyet a BirA specifikusan biotinilál. A pöttyös dobozok a két GATA-1 cink-ujj pozícióját jelzik. A jelölt GATA-1-et és BirA-t külön-külön klónoztuk egy emlős eritroid expressziós kazettába, és MEL sejtekben koexprimáltuk. (B) A jelölt GATA-1 biotinilálása MEL sejtekben. (Balra) Western blot anti-GATA-1 antitesttel az endogén és a jelölt GATA-1 fehérjék kimutatására. (Jobbra) Ugyanezen kivonatok Western blotja sztreptavidin-HRP konjugátummal a biotinilált GATA-1 kimutatására. A kettős transzfektánsokból (1. és 5. sáv) és az egyszeres transzfektánsokból (2., 3., 6. és 7. sáv) származó nukleáris kivonatokat (5 μg/sáv) a jelölt GATA-1 és a Bir A számára vizsgáltuk. A 4. és 8. sávban nem transzfektált MEL sejtekből származó nukleáris kivonat. A biotinilált GATA-1 (csillag) csak a kétszeresen transzfektált sejtek sávjában látható egyértelműen. Szintén jelezve van a sztreptavidin által kimutatott alacsony háttér a csak BirA-t expresszáló sejtekből származó MEL sejtmagkivonatokban (jobbra, 7. sáv). (C) A GATA-1 biotinilálásának és a streptavidin gyöngyökhöz való kötődésének hatékonysága. (Balra) Western blot anti-GATA-1 antitest alkalmazásával a jelölt GATA-1 streptavidin gyöngyökhöz való kötődésének kimutatására (2. sáv; a kötődéshez használt kiindulási anyag a bemeneti sávban látható nukleáris kivonat mennyiségének 2,5-szerese volt). A bemeneti és a nem kötött anyag az 1. és 3. sávban látható. (Jobbra) Ugyanez a szűrő lecsupaszítva és sztreptavidin-HRP-vel újrakeverve a biotinilált GATA-1 sztreptavidin gyöngyökhöz való kötődésének kimutatására (5. sáv). A 6. sávban látható, hogy nagyon kevés jelölt GATA-1 nem kötődik a streptavidinhez. Ebben a kötődési kísérletben a gyöngyöket szigorú körülmények között mostuk (0,5 M NaCl/0,3% Triton X-100 PBS-ben). In, input (nukleáris kivonat); El, eluált anyag; Un, nem kötött anyag.
A rendszer tesztelése során megjelölt fehérje az alapvető fontosságú egér vérképzőszervi transzkripciós faktor, a GATA-1 volt (áttekintésért lásd a 25. hivatkozást). A tag-et N-terminálisan a GATA-1-hez fuzionáltuk és egy humán β-globin expressziós kazetta kontrollja alatt MEL sejtekben expresszáltuk, amelyek indukálhatók a terminális erythroid sejtdifferenciálódásra (22). A BirA-t szintén klónoztuk és MEL sejtekben expresszáltuk a humán globin expressziós kazetta segítségével. A jelölt GATA-1 és BirA egyszeres és kettős stabil transzfektánsainak megfelelő klónokat izoláltuk, és kezdetben mindkét konstrukció expresszióját vizsgáltuk. A GATA-1 esetében a GATA-1 antitestet használó Western blot analízis a lassabban vándorló jelölt fehérjét és az endogén GATA-1-et is kimutatta a transzfektált sejtekből származó magkivonatokban (1B. ábra, 1. és 2. sáv). A BirA expresszióját RNS-szinten elemeztük (az adatok nem láthatóak).
A következőkben kiválasztott stabil transzfektánsokon megvizsgáltuk, hogy a jelölt GATA-1 fehérjét biotinilálja-e a BirA. A MEL sejtklónokból származó magkivonatok sztreptavidin-HRP konjugátummal történő vizsgálata a jelölt GATA-1 fehérjének megfelelő robusztus jelet mutatott, amely csak a jelölt GATA-1/BirA kettős transzfektáns sávjában volt kimutatható (1B. ábra, 5. sáv). BirA hiányában nem látható a jelölt GATA-1 biotinilációja (1B. ábra, 6. sáv). Ezek az eredmények megerősítik, hogy a BirA fehérje aktív formában szintetizálódik a transzfektált MEL sejtekben. Ezenkívül nagyon kevés nemspecifikus háttér biotiniláció figyelhető meg a csak BirA-t expresszáló MEL sejtmagkivonatokban (1B. ábra, 7. sáv). Ebből arra következtetünk, hogy a bakteriális BirA fehérje-biotin ligáz MEL sejtekben történő expressziója képes specifikusan biotinilálni egy egyedi peptidcímkével ellátott emlős transzkripciós faktort.
A következőkben a biotinilálás hatékonyságát vizsgáltuk a nyers magkivonatokban lévő jelölt GATA-1 sztreptavidin paramágneses Dynabeadshez kötésével (1C. ábra). A gyöngyökből eluált anyag elemzése azt mutatta, hogy szinte az összes jelölt GATA-1 fehérje kötődött (hasonlítsuk össze a 2. sávot az 1. és 3. sávval, 1C. ábra). Ugyanennek a szűrőnek a sztreptavidin-HRP-vel történő újrapróbálása ≈100%-os hatékonyságot mutat a jelölt GATA-1 biotinilálásában és a gyöngyök általi befogásában (1C. ábra, 4. és 5. sáv). Ezenkívül, összhangban az 1B. ábrán látottakkal, az endogén biotinilált fehérjéknek a gyöngyökhöz való kötődése a sztreptavidin-HRP-vel kimutathatóan csekély háttérben van (1C. ábra, 5. sáv). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a jelölt GATA-1 nagyon hatékonyan biotinilálódik és nyerhető ki a kivonatokból sztreptavidin kötéssel, elhanyagolható háttér biotiniláció mellett.
A biotinilált GATA-1 egylépéses tisztítása nyers magkivonatokból sztreptavidin kötéssel. Megvizsgáltuk az egylépéses tisztítás megvalósíthatóságát is a biotinilált GATA-1 nyers magkivonatokból történő izolálásában, sztreptavidin gyöngyökhöz való közvetlen kötődéssel, mérsékelt szigorítás mellett (150 mM NaCl/0,3% Nonidet P-40/200 ng/μl csirkeszérum-albumin). Először a csak BirA-t expresszáló MEL sejtek 5 mg nyers magkivonatából származó kontroll kötést próbáltuk ki (2. ábra, 4. sáv). Az eluált anyag körülbelül öt erősen festett sávból állt a sokkal halványabb sávok hátterében (2. ábra, 5. sáv). A háttérben kötődő fehérjéket úgy azonosítottuk, hogy a teljes sávot kivágtuk a gélből, és folyadékkromatográfiás-tandem MS-sel elemeztük. Az így azonosított fehérjéket az 1. táblázatban a Gene Ontology Consortium (www.geneontology.org) által meghatározott biológiai funkció és sejtkompartment szerint osztályoztuk. Az eredmények azt mutatták, hogy a legnagyobb mennyiségben azonosított háttérfehérjék a természetesen biotinilált karboxilázok és a hozzájuk kapcsolódó enzimek voltak, amelyek nagyrészt egybeestek az intenzíven festődő sávokkal. Az mRNS-feldolgozásban részt vevő bőséges nukleáris fehérjék, például a splicing faktorok, valamint a riboszómális fehérjék háttérkötődését is megtaláltuk. Ez a három fehérjeosztály együttesen a háttérkötődés >80%-át tette ki az alkalmazott körülmények között (1. táblázat). Figyelemre méltó, hogy nagyon kevés peptidet azonosítottak a transzkripciós szabályozásban részt vevő faktoroknak megfelelőként (1. táblázat). Arra a következtetésre jutottunk, hogy a sztreptavidin gyöngyökhöz való háttérkötődés főként az endogén biotinilált fehérjéknek, valamint az mRNS-feldolgozásban és a riboszómaszintézisben és -összeszerelésben részt vevő, nagy mennyiségben előforduló nukleáris faktoroknak köszönhető, a transzkripciós szabályozásban/aktiválásban részt vevő faktorok nemspecifikus kötődése pedig nagyon kevés.
Kolloidkékkel festett gél nyers magkivonatok sztreptavidin gyöngyökhöz való kötődési kísérletéről. 1. sáv, marker (M). 2. sáv, GATA-1/BirA kettős transzfektált sejtekből származó bemeneti magkivonat (≈12 μg). 3. sáv, címkézett GATA-1/BirA transzfektált sejtek ≈5 mg nyers magkivonatának sztreptavidin gyöngyökhöz való közvetlen kötése után eluált fehérjék. 4. sáv, a jelölt GATA-1/BirA transzfektált sejtekből származó bemeneti magkivonat. 5. sáv, a BirA transzfektált sejtekből származó ≈5 mg nukleáris kivonat sztreptavidin gyöngyökhöz való kötődése után eluált fehérjék. A 3. sávban lévő nyíl jelzi a tisztított biotinilált GATA-1-et tartalmazó fehérjesávot, amelyet MS-sel határoztak meg.
- View inline
- View popup
A következőkben a jelölt GATA-1/BirA kettős transzfektánsokból származó hasonló mennyiségű (5 mg) nyers magkivonat (2. ábra, 2. sáv) kötésével próbálkoztunk, ugyanilyen körülmények között (2. ábra, 2. sáv). Az eluált anyagot tartalmazó sáv (2. ábra, 3. sáv) festési mintázata jelentősen különbözött az 5. sávban megfigyelt háttérkötésnél tapasztaltaktól, ami a jelölt GATA-1-gyel koelektálódó fehérjék jelentős feldúsulására utal (2. ábra, 3. sáv vs. 5. sáv). A biotinilált GATA-1 és a koelúciós fehérjék felhígulhatnak, vagy versenyezhetnek a kötődésért az 5. sávban megfigyelt nem specifikus fehérjékkel. A 3. sávban látható fehérjedúsulás így a kopurifikált GATA-1-interakcióban lévő fehérjéknek felelhet meg. Az eluált anyagban egy erősen festett sávot is megfigyeltünk, amely a jelölt GATA-1-re várt mérethez hasonlóan vándorolt (2. ábra, nyíl, 3. sáv). A GATA-1 jelenlétét ebben a sávban gélkivágással és MS-sel igazoltuk. A jelölt GATA-1-gyel kopurifikálódó összes fehérje részletes elemzését máshol fogjuk publikálni (P.R., F.G. és J.S., publikálatlan eredmények). Összességében ezek az adatok bizonyítják a jelölt GATA-1 kvantitatív biotinilálását MEL sejtekben és hatékony tisztítását nyers fehérjeextraktumokból egylépéses eljárással, sztreptavidin gyöngyökhöz való közvetlen kötődéssel, kevés háttérkötési sávval, amelyek elsősorban endogén biotinilált fehérjéknek és könnyen azonosítható bőséges nukleáris/nukleoláris fehérjéknek felelnek meg.
A biotinilálás nem befolyásolja a GATA-1 fehérje-interakciós vagy DNS-kötő tulajdonságait. Mivel lehetséges, hogy a peptidcímke és/vagy a biotiniilálás hozzáadása befolyásolja a jelölt fehérje tulajdonságait, megvizsgáltuk, hogy a biotiniilált GATA-1 továbbra is képes-e fehérje-fehérje kölcsönhatásokba lépni egy ismert GATA-1 partnerrel, például a FOG-1-gyel (26), és képes-e in vivo kötődni ismert GATA-1 géncélpontokhoz, például az egér βmaj globin promóteréhez. Elvégeztük a biotinilált GATA-1 pull-down kísérletét magkivonatok sztreptavidin gyöngyökhöz kötésével, és megvizsgáltuk, hogy a FOG-1 is kopurifikálódik-e. Megállapítottuk, hogy a FOG-1 a biotinilált GATA-1-et expresszáló kivonatokból lehúzódott, de a csak BirA-t expresszáló kivonatokból nem (3A ábra, 2. és 4. sáv). Azt is megállapítottuk, hogy a FOG-1 kopurifikálódik a biotinilált GATA-1-gyel MS segítségével. Kromatin pull-down (ChIP) kísérletet is végeztünk, amelyben formaldehiddel keresztkötésű MEL sejtekből szonikázott kromatint inkubáltunk sztreptavidin gyöngyökkel, majd a megkötött anyag eluálása és a pull-down DNS kinyerése következett. A βmaj promóterre specifikus primerek használatával e szekvenciák feldúsulását találtuk a biotinilált GATA-1-et expresszáló sejtek kromatinjából lehúzott DNS-ben, de a BirA-t expresszáló sejtekből nem (3B. ábra). Azt is megállapítottuk, hogy a biotiniilálás nem befolyásolja a GATA-1-nél általában megfigyelhető szubnukleáris eloszlást (5. ábra, amely a PNAS weboldalon támogató információként jelent meg; hivatkozás 27), és hogy a biotiniilált GATA-1 a MEL sejtmagkivonatokban az endogén GATA-1-gyel azonos biokémiai frakcionálási profilt mutat (adat nem látható). Ezek az eredmények együttesen erős bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy a GATA-1 tulajdonságait nem befolyásolja a biotinilációs jelölés. Ezen túlmenően ezek az adatok azt is bizonyítják, hogy a biotiniilációs jelölés az antitestek alternatívájaként alkalmazható olyan affinitás-tisztítási lépést igénylő módszerekben, mint például a fehérje pull-down vagy a ChIP-teszt.
(A) A biotinilált GATA-1 kötése sztreptavidin gyöngyökhöz specifikusan lehúzza a FOG-1-et, amint azt Western blottinggal detektáltuk egy FOG-1 antitest használatával. Ezzel szemben a FOG-1 nem húzható le streptavidinnel a csak BirA-t expresszáló biotinilált magkivonatokban (jobbra). A FOG-1 doubletként detektálható (26). (B) A βmaj globin promóter szekvenciák streptavidin pull-downja a biotinilált GATA-1-et (balra) vagy csak BirA-t (jobbra) expresszáló MEL sejtek keresztkötésű kromatinjából. A háromszögek a βmaj szekvenciák amplifikációjának kimutatására szolgáló PCR-reakciókban templátként használt keresztkötésű kromatin növekvő mennyiségét jelzik. A βmaj szekvenciák specifikus feldúsulása figyelhető meg a biotinilált GATA-1-et expresszáló sejtekből származó húzott kromatinban, de a csak BirA-t expresszáló sejtekben nem.
Biotinilációs jelölés transzgenikus egerekben. A biotinnal jelölt fehérje nyers kivonatokból történő közvetlen izolálásának képessége egyetlen lépésben felveti annak lehetőségét, hogy ezt a megközelítést limitáló forrásokból, például egérszövetekből származó jelölt fehérjék tisztításában alkalmazzák. Ezért megvizsgáltuk, hogy a BirA-mediált biotinilációs jelölés in vivo is működik-e transzgenikus egerekben. Mivel a GATA-1 túlexpressziója egerekben embrionális letalitáshoz vezet (28), ezt a megközelítést az EKLF (29) esszenciális erythropoetikus transzkripciós faktor jelölésével teszteltük. Az egér EKLF cDNS-t biotinilációs címkével és kettős hemagglutinin epitóppal jelöltük, és transzgénikus egérvonalak létrehozásához egér petesejtekbe mikroinjekcióztuk. Hasonlóképpen, transzgénikus egérvonalakat hoztak létre a BirA/erythroid expressziós kazetta konstrukció mikroinjekciójával. Kiválasztották és keresztezték azokat a transzgenikus egérvonalakat, amelyekben a jelölt EKLF és BirA kimutathatóan kifejeződött az eritroid sejtekben. A jelölt EKLF in vivo biotinilációját 13,5 napos posztkoitum embriók magzati májából készített nukleáris kivonatokban vizsgáltuk. Az anti-EKLF antitesttel végzett Western blot analízis kimutatta az endogén EKLF-et, valamint a jelölt EKLF-et, amely doubletként volt látható (4. ábra, 1. sáv). A magzati májmagkivonatok sztreptavidin gyöngyökhöz kötése azt mutatja, hogy a doubletben csak a felső sáv maradt meg, ami arra utal, hogy biotinilált (4. ábra, 2. és 3. sáv). Ezt a megfigyelést megerősíti ugyanennek a blotnak a sztreptavidin-HRP-vel történő szondázása, amely csak egyetlen sávot detektál (4. ábra, 7. és 9. sáv). Az EKLF antitest által detektált doublet valószínűleg a transzláció iniciációs kodonok eltérő felhasználásának köszönhető az N-terminálisan fuzionált biotinilációs tagnél (felső sáv) és a közvetlenül alatta lévő kettős hemagglutinin epitópnál, amely szintén tartalmaz egy iniciációs kodont (alsó sáv). Ennek eredményeképpen csak a biotiniilációs taggel ellátott felső sáv szolgál szubsztrátként a BirA számára, ami tovább bizonyítja e megközelítés in vivo specifitását. A magkivonatok sztreptavidin gyöngyökhöz való kötődése azt is megmutatta, hogy a transzgenikus egerek magzati májában a jelölt EKLF jelentős része (≈50%) biotinilálódik. Feltételezzük, hogy a transzfektált sejtek és a magzati májak közötti biotinilálási hatékonyságbeli különbség (a különböző fúziós fehérjék használatán kívül) a biotin elérhetőségének in vivo korlátozottságát tükrözheti (a biotin bőségesen megtalálható a sejttenyésztő médiumok kiegészítésére használt FCS-ben) vagy a BirA expressziós szintjének különbségét. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a jelölt EKLF bakteriális BirA általi specifikus biotinilálása in vivo is nagy hatékonysággal megvalósítható transzgenikus egerekben.
A jelölt EKLF specifikus biotiniilálása transzgenikus egér embriókban. Egy jelölt EKLF/BirA kettős transzgénikus vonalból (1-3. és 7-9. sáv) és egy jelölt EKLF transzgénikus vonalból (4-6. sáv) származó 13,5 napos postcoitum embriók magzati májából származó nukleáris kivonatokat kötöttünk sztreptavidin gyöngyökhöz. A jelölt és biotinilált EKLF-et a bemeneti magkivonatban, a nem kötött anyagot (sup., felülúszó) és a kötött anyagot EKLF antitesttel (balra) vagy streptavidin-HRP-vel (jobbra) detektáltuk. Az EKLF biotiniláció és a gyöngyökhöz való kötődés csak a kettős transzgenikus embriókból származó kivonatokban mutatható ki.