- A folyadékkromatográfia-tandem négypólusú tömegspektrometriás rendszerek
- A szilárd fázisú extrakciós módszer kifejlesztése
- A diazepam és nordiazepam stabilitása savas és semleges vizes mintákban
- A szilárd fázisú extrakciós visszanyerés szimulált környezeti vízmintáknál, alacsony minta pH-n tárolva
- A nordiazepám regenerálódása a mintaelőkészítés során
- A módszer validálása
- Diazepám és nordiazepám mennyiségi meghatározása környezeti vízmintákban
A folyadékkromatográfia-tandem négypólusú tömegspektrometriás rendszerek
A kifejlesztett izokratikus, valamint a gradiens elúciós rendszerek jó csúcsfelbontást (Rs ≥ 3,1) adtak a diazepám és a nordiazepám esetében. Az izokratikus rendszerben a retenciós idő 2,6 perc (0,54 RSD %) és 4,1 perc (0,27 RSD %) volt a nordiazepam-d5 és a diazepam-d5 standardok esetében. A felszíni vizes mátrixban a retenciós idők megegyeztek a standardokéval, és az RSD értékek 0,62% és 0,30% voltak a nordiazepam-d5 és a diazepam-d5 esetében. A munkastandardok retenciós ideje a gradiens rendszerben 2,4 perc (0,90 RSD %) és 2,9 perc (0,70 RSD %) volt a nordiazepám és a diazepám esetében. A kezelt szennyvízben lévő vegyületek retenciós idejének pontosságát az 1. táblázat tartalmazza, ahol az RSD értékek ≤ 0,35% voltak.
A diazepámot és a nordiazepámot a kezelt szennyvízmintákban a jellegzetes MS/MS átmenetek és retenciós idők alapján azonosították (1. táblázat). Minden egyes vegyület esetében egy prekurzoriont és két fragment iont figyeltünk meg. A “természetesen” előforduló diazepám és nordiazepám azonosításához a két fragmentumionból kapott csúcsterületek arányát hasonlították össze a standardokéval (1. táblázat). Továbbá a célvegyületek retenciós idejét összehasonlítottuk a diazepam-d5 és nordiazepam-d5 retenciós idejével ugyanabban a kromatográfiás futtatásban.
A szilárd fázisú extrakciós módszer kifejlesztése
A diazepam és nordiazepam stabilitása savas és semleges vizes mintákban
A gyűjtött környezeti vízmintákat általában savas pH-n tárolják a megjelenő szennyezőanyagok elemzése előtt . Ebben a tanulmányban a diazepám és a nordiazepám stabilitását vizsgálták, amikor munkastandardként tárolták (pH 3,1 és pH 7,0 mellett). Megállapították, hogy a nordiazepam nagymértékben lebomlott, amikor szobahőmérsékleten, savas oldatban tárolták. A nordiazepám 56%-a 12 napon belül lebomlott (2. ábra). A lebomlás nem volt ilyen mértékű, amikor a munkaoldatot 4 °C-on tárolták; 12 nap elteltével a nordiazepam kezdeti koncentrációjának 20%-a bomlott le. Másrészt a diazepám szobahőmérsékleten és 4 °C-on tárolva stabilnak bizonyult 3,1-es pH-n (2. ábra). A 12 nap alatt a diazepámnak csak 0,53%-a, illetve 3,1%-a bomlott le szobahőmérsékleten, illetve 4 °C-on. Mindkét vegyület semleges pH-n 12 napig stabilnak bizonyult. A 12. napon a diazepám és a nordiazepám reakciója (4 °C-on és szobahőmérsékleten tárolva) a kezdeti reakciók 101-103%-a volt. A különböző időpontokban meghatározott koncentráció RSD-értékei (n = 3) ≤ 5,1% voltak. A reakciót eredetileg szennyvízmintákban fedezték fel, de a kísérleteket elkészített oldatokban végezték, hogy egyszerűsítsék a feltételeket és csökkentsék az egyéb reakciók/hatások lehetőségét a szennyvíz nagyon összetett mátrixában.
A diazepám és a nordiazepám stabilitása 5 mM hangyasavban, tisztított vízben, pH 3. A diazepám 4 °C-on (fehér háromszög) és szobahőmérsékleten (fekete háromszög) tárolt diazepám. 4 °C-on (fehér négyzet) és szobahőmérsékleten (fekete négyzet) tárolt nordiazepám. A kísérleti részleteket a “Diazepám és nordiazepám stabilitási vizsgálatai savas és semleges vizes oldatokban”
Eredményeink szerint a nordiazepám pH 3-nál instabil, ezek az eredmények összhangban vannak az irodalmi eredményekkel, amelyek szerint a nordiazepám savas oldatokban hidrolízisnek megy keresztül. Archontaki és munkatársai megállapították, hogy a nordiazepám savas vizes oldatokban hidrolizálódik, és hogy a lebomlás első lépése reverzibilis. A jelen vizsgálat eredményei azonban ellentétesnek tűnhetnek egy nemrégiben végzett vizsgálat eredményeivel, ahol azt találták, hogy a nordiazepám (és a diazepám) pH 2-nél stabilabb, mint pH 7-nél . A különbség tulajdonképpen várható, ha figyelembe vesszük a visszanyerés meghatározásának különböző stratégiáit. Mivel a nordiazepám átalakulása a bepárlás és a melegítés során megfordul, a módszer rutinszerű alkalmazása szempontjából nem feltétlenül van gyakorlati következménye. Csak ha a visszanyerést a Matuszewski et al. ajánlásai szerint becsüljük, a nordiazepam alacsony pH-n való instabilitásával kombinálva, akkor kapjuk a vegyület veszteségét és így a látszólag magas visszanyerést.
A szilárd fázisú extrakciós visszanyerés szimulált környezeti vízmintáknál, alacsony minta pH-n tárolva
A szilárd fázisú extrakciós visszanyerést és a mátrixhatást kezelt vízmintákban LC-MS segítségével határoztuk meg a Matuszewski et al. által javasolt megközelítéssel, a részletek a “Módszer validálása” című fejezetben találhatók. Az extrakciós visszanyerést az izotópokkal jelölt standardok, a diazepam-d5 és a nordiazepam-d5 esetében határoztuk meg, mivel a jelölt vegyületek várhatóan nem találhatók meg a környezeti mátrixokban. A jelen vizsgálatban a diazepam-d5 és a nordiazepam-d5 munkastandardjait 5 mM hangyasavban, tisztított vízben pH 3,1/acetonitril (90/10, v/v), legfeljebb 1 hétig tárolták 8 °C-on, és az A-C készletek elkészítéséhez használták.
A 2. táblázatban egy alacsony és egy magas koncentrációnál meghatározott relatív extrakciós visszanyerés szerepel (az extrakciós módszert a “Mintaelőkészítés és szilárd fázisú extrakció” című fejezetben ismertetjük). Az extrakciós visszanyerés magasabb volt a nordiazepam-d5 esetében, mint a diazepam-d5 esetében. A nordiazepam-d5 esetében a relatív extrakciós visszanyerés 114 ± 8,1% és 117 ± 21% volt alacsony, illetve magas koncentráció esetén. A diazepam-d5 esetében kapott RSD értékek 6,0% és 24% voltak az alacsony és a magas koncentráció esetén (2. táblázat). A szilárd fázisú extrakciós eljárás esetében az RSD magas értékeit (≥ 18%) néha összetett mátrixokban végzett nyomszintű meghatározásoknál kapjuk. Továbbá a szakirodalomban korábban már beszámoltak a nordiazepám magas extrakciós visszanyeréséről (≥ 100%) környezeti vízmintákban . Amint azt alább tárgyaljuk, a magas visszanyerés összefüggésbe hozható a nordiazepam és egy átalakulási termék közötti kémiai egyenlőséggel.
A nordiazepam-d5 abszolút extrakciós visszanyerését 139 ± 21%-ban, a mátrixhatást pedig 119 ± 3,0%-ban határoztuk meg. A nordiazepam-d5 magas abszolút extrakciós visszanyerése részben azzal magyarázható, hogy a nordiazepam-d5 ionerősítésnek volt kitéve az MS-felületen. Kimutattuk azonban, hogy a magas extrakciós visszanyerést (> 100% a relatív extrakció esetében, amint azt fentebb tárgyaltuk) nem csak az ESI-forrás mátrixhatása okozta. Ezt a Matuszewski et al. szerint kapott relatív extrakciós visszanyerésekkel állapítottuk meg, ahol az extrahált és a nem extrahált mintákat ugyanabban a mátrixban feloldva injektáltuk az LC-MS/MS rendszerbe. Ezenkívül annak további ellenőrzése érdekében, hogy a magas extrakciós visszanyerés nem függött össze a tömegspektrométer határfelületén zajló folyamattal, a diazepam-d5 és a nordiazepam-d5 extrakciós visszanyerését egy második detektálási technika, az LC-UV alkalmazásával határozták meg. A nordiazepam-d5 egy foszfátpufferben (pH 7,0) extrahált és LC-MS/MS-sel és LC-UV-vel egyaránt elemzett mintájának visszanyerése 159, illetve 153% volt (n = 2). Arra a következtetésre jutottunk, hogy a nordiazepam magas extrakciós visszanyerése nagymértékben nem a tömegspektrométerben zajló folyamatnak tulajdonítható.
Végeredményben, bár a kapott extrakciós visszanyerések és RSD-értékek magasak voltak, valószínűleg ésszerűnek tűnnek, mivel a célvegyületek koncentrációja alacsony volt (50 és 250 pM), és mivel a vegyületeket komplex mátrixból extraháltuk. Ebben a vizsgálatban azt kívántuk bizonyítani, hogy a nordiazepám esetében kapott magas visszanyerések összefüggésbe hozhatók a nordiazepám és egy Archontaki és munkatársai által talált átalakulási termék közötti kémiai egyenlőséggel.
A nordiazepám regenerálódása a mintaelőkészítés során
Ha a diazepám és a nordiazepám tárolt oldatai (pH 3.1, szobahőmérsékleten, “A diazepám és a nordiazepám stabilitása savas és semleges vizes mintákban”) foszfátpufferrel spékeltük, majd szilárd fázisú extrakciónak vetettük alá, a nordiazepám rekonstruált kivonataiból kapott válaszok nagyobbak voltak a nem extrahált tárolt oldatokból kapott válaszokhoz képest. A szilárd fázisú extrakcióval a nordiazepam csúcsterülete 26 területszámról (2,7 RSD %, n = 3) 45 területszámra (14,6 RSD %, n = 3) nőtt.
Annak ellenőrzésére, hogy a nordiazepam regenerálódott-e a szilárd fázisú extrakció során, egy tárolt nordiazepam-d5 mintát (amely 1470-es csúcsterületet adott az m/z 213-as fragmentumionhoz) és egy feldolgozott nordiazepam-d5 mintát (1790-es csúcsterülettel) injektáltunk az LC-MS/MS rendszerbe. A nordiazepam-d5 SRM-csatornáján (276 → 213) kívül két további SRM-csatornát szereztünk be, 1. táblázat. A nordiazepam-d5 tárolt mintáit injektáltuk (n = 6), és az SRM-átmenetek arányát 1,4 (3,8 RSD %, fragmention-arány m/z (276 → 213)/(276 → 165) és 1,0 (3,5 RSD %, fragmention-arány m/z (276 → 213)/(276 → 140) értékben határoztuk meg. A nordiazepam-d5 feldolgozott mintájánál az SRM-átmenetek aránya megegyezett, azaz 1,4 és 1,0 volt. Így a fragmentumion-arányokban nem volt jelentős különbség a tárolt és a feldolgozott minták között. Továbbá a retenciós idők mindkét minta esetében azonosak voltak. Arra a következtetésre jutottak, hogy mind a tárolt, mind a feldolgozott mintákban a nordiazepam-d5 volt kimutatható.
Archontaki és munkatársai megállapították, hogy a nordiazepam savas vizes oldatban a köztes N-(2-benzoil-4-klórfenil)-2-aminoacetamiddá alakul át, amelynek molekuláris képlete C15H13N2O2Cl, monoisotópos tömege 288,1 Da. Az átalakulási terméket kristályosítottuk és LC-UV, GC-MS, 1H- és 13C-NMR, valamint IR spektroszkópiával elemeztük. A köztitermék és a nordiazepam kémiai egyensúlya reverzibilis volt, a köztitermék további átalakulása a végső bomlástermékké (C13H10NOCl) azonban nem volt reverzibilis. Jelen vizsgálatban a nordiazepám tárolt oldatában (pH 3,1) egy 3,0 perces retenciós idővel és 289,0 tömeg-töltés aránnyal rendelkező iont mutatott ki az LC-MS. Ez az ion a nordiazepam + átalakulási termékének felelhet meg. Továbbá az ion izotópmintázata 3,0 percnél megegyezett egy klóratom izotópmintázatával. Ezenkívül a kromatográfiás csúcs a nordiazepám előtt eluálódott, ami összhangban van a nordiazepám és az N-(2-benzoil-4-klórfenil)-2-aminoacetamid elválasztásának eredményeivel az Archontaki et al. által használt fordított fázisú rendszerben. Így a tárolt savas vizes oldatban kimutatott csúcs ebben a vizsgálatban valószínűleg N-(2-benzoil-4-klórfenil)-2-aminoacetamid volt. Továbbá, a nordiazepam és az N-(2-benzoil-4-klórfenil)-2-aminoacetamid csúcsterületének aránya 0,75 (n = 2) volt ebben a tárolt vízoldatban a bemutatott vizsgálatban. A bepárolt metanolos keverékekben (a kísérleti részleteket a “Diazepám és nordiazepám stabilitási vizsgálatai savas és semleges vizes oldatokban” című fejezetben ismertettük) azonban a nordiazepám és az N-(2-benzoil-4-klórfenil)-2-aminoacetamid csúcsterületének aránya 1,9-re nőtt (6,8 RSD %, n = 4), azaz, a nordiazepam csúcsterülete nőtt, az N-(2-benzoil-4-klórfenil)-2-aminoacetamid csúcsterülete pedig csökkent a be nem párolt mintához képest. Az N-(2-benzoil-4-klórfenil)-2-aminoacetamid vagy a nordiazepám esetében nem mutattak ki csúcsokat az üres mintában. Ezek az eredmények határozottan arra utalnak, hogy a nordiazepám és az Archontaki és munkatársai által jellemzett nordiazepám átalakulási termékének kémiai egyensúlya az N-(2-benzoil-4-klórfenil)-2-aminoacetamidból nordiazepámmá változott az SPE-kivonatok bepárlása során. Nem észleltek olyan csúcsot, amely a nordiazepám végső bomlástermékével (C13H10NOCl) korrelálható lett volna.
Azt a következtetést vonták le, hogy a nordiazepám könnyen átalakul N-(2-benzoil-4-klórfenil)-2-aminoacetamiddá a savas vizes oldatban. Érdekes módon a nordiazepám a szilárd fázisú extrakció során regenerálódott. Így a nordiazepam 3,0 pH-n tárolt oldatainak referenciaként való felhasználásával az extrakciós visszanyerés számításai során az extrakciós visszanyerés túlbecsült. Ezek az eredmények fontosak a módszer validálása során, azaz a tárolási körülmények, az extrakciós visszanyerés és a mátrixhatások értékelése során. Ezenkívül a nordiazepám átalakulása befolyásolhatja az általános analitikai eredményeket, ha nem a nordiazepám izotópokkal jelölt analógját használják belső standardként. Azt is hangsúlyozni kell, hogy a nordiazepám átalakulása befolyásolhatja a módszer pontosságát, nemcsak a szilárd fázisú extrakciót megelőző tárolás során, hanem a használt oldat pH-jától függően is, pl. a szárított SPE-kivonatok rekonstrukciója során.
A módszer validálása
A kifejlesztett módszert a diazepam-d5 és nordiazepam-d5 izotóp-jelölt analógok használatával validáltuk (“A módszer validálása”), mivel ezeket a vegyületeket nem mutatták ki a környezeti mintákban. A jelölt analógok használatának előnye a módszer validálásához az, hogy a módszer nyomokban validálható abban a tényleges mátrixban, amelyben az analiteket számszerűsítik. A relatív extrakciós visszanyerés a kezelt szennyvízmintákban ≥ 87% volt a diazepam-d5 és a nordiazepam-d5 esetében a magas és alacsony koncentrációban (3. táblázat). A kapott értékek az összetett mátrixokból kivont gyógyszerhatóanyagok nyomszintű koncentrációi esetén elvárható tartományokba esnek. Az abszolút extrakciós visszanyerés alacsonyabb, 63-86% volt, mivel az analiteket ionszuppressziónak vetették alá (3. táblázat). Alacsony koncentráció esetén a mátrixhatás (ME %) 76 ± 14% és 88 ± 14% volt a diazepam-d5 és a nordiazepam-d5 esetében (3. táblázat). A magas koncentrációnál a mátrix hatása és az RSD-értékek ugyanabban a tartományban voltak, mint az alacsony koncentrációnál. Ezek a ME % értékek az elfogadható tartományon belül vannak, mivel más vizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy a környezeti vízmátrixokkal kapott mátrixhatás viszonylag magas lehet. A módszer pontosságát a diazepam-d5 és a nordiazepam-d5 alacsony és magas koncentrációjánál az SPE visszanyerés meghatározásával határoztuk meg (3. táblázat). A relatív visszanyerés 88 ± 7,6% és 87 ± 12% volt a diazepam-d5 esetében alacsony és magas koncentrációban, illetve 98 ± 7,8% és 99 ± 6,1% a nordiazepam-d5 esetében.
A kromatográfiás rendszer pontossága, a diazepam-d5 és nordiazepam-d5 extrahált szennyvízmintákban kapott retenciós idők RSD értékeiben kifejezve ≤ 0,62% volt. Az extrahált szennyvízmintákban a diazepam-d5 és a nordiazepam-d5 csúcsterületeinek RSD-értékei ≤ 7,8% voltak (“A folyadékkromatográfiás tandemnégypólusú tömegspektrometriás rendszerek”). Továbbá a linearitás, amelyet a kalibrációs görbék korrelációs együtthatójaként (R2) fejeztek ki a kezelt szennyvízmintákban, 0,988 és 0,957 volt a diazepam és a nordiazepam esetében.
Ebben a vizsgálatban az LC-MS/MS rendszerben nem figyeltek meg átvitelt, mivel az analitok vagy az izotópokkal jelölt vegyületek csúcsait nem mutatták ki egyik injektált tisztított Millipore vízmintában sem. Nem volt jele annak, hogy a mintakezelés vagy a szilárd fázisú extrakció során keresztkontamináció történt volna, mivel a kivont foszfátpuffer minták nem tartalmazták a célvegyületeket. Az önkontamináció következtében kapott hamis pozitív eredmények kockázatát ezért ebben a vizsgálatban minimálisra csökkentettnek tekintették.
A diazepam-d5 és a nordiazepam-d5 LOQ-ját és LOD-ját tisztított szennyvízmintákban határozták meg. A mennyiségi meghatározási határokat 5,0 pM (1,4 ng L-1) értékben határoztuk meg mind a diazepam-d5, mind a nordiazepam-d5 esetében, ahol a jel-zaj arány körülbelül 10 volt, és a kapott pontosság 12,7 és 15,9 RSD % (n = 3) volt az adott vegyületek esetében (3. táblázat), azaz az előírt 20%-os pontosságon belül. A jelen vizsgálatban kapott LOQ-értékek a kezelt szennyvízmintákban a diazepám és a nordiazepám esetében más vizsgálatokban elért értékek tartományába esnek. Az említett vizsgálatban azonban 200 ml kezelt szennyvizet extraháltak, míg a mi módszerünkben 75 ml-t. A kimutatási határértékek 1,7 pM (0,49 ng L-1) és 2,0 pM (0,55 ng L-1) voltak a diazepam-d5 és a nordiazepam-d5 esetében (3. táblázat).
Amint azt fentebb tárgyaltuk (“A diazepam és nordiazepam stabilitása savas és semleges vizes mintákban”, 2. ábra), a diazepam és nordiazepam 12 napig stabilnak bizonyult a minta 7-es pH-értéke mellett.0, ha szobahőmérsékleten vagy 4 °C-on tárolták.
Diazepám és nordiazepám mennyiségi meghatározása környezeti vízmintákban
A kifejlesztett LC-MS/MS módszert környezeti vízmintákra alkalmaztuk a diazepám és nordiazepám meghatározására. Hangsúlyozni kell, hogy a kifejlesztett módszer alkalmazható a diazepám és a nordiazepám meghatározására környezeti mintákban savas körülmények között, ha a mintákhoz a tárolás előtt ideális belső standardokat, azaz a célvegyületek izotópokkal jelölt vegyületeit adjuk. Ebben a vizsgálatban a diazepam-d5 és nordiazepam-d5 izotópjelzett vegyületeket használtuk belső standardként, hogy kompenzáljuk a vegyületek esetleges átalakulását és egyéb veszteségeit, valamint az elemzés során bekövetkező változásokat.
A kezelt szennyvíz- és felszíni vízmintákat diazepam és nordiazepam tekintetében elemeztük. A standard oldatokra kapott ionarányok (1. táblázat) és a “természetesen” előforduló diazepamra vagy nordiazepamra kapott ionarányok között nem volt szignifikáns különbség 5%-os szinten, t-teszt segítségével (P ≥ 0,07). A diazepám és a nordiazepám koncentrációját 8,5 (2,4 ng L-1), illetve 66 pM (18 ng L-1) értékben határoztuk meg. Az ugyanabból a szennyvíztisztító telepről 14 nappal később gyűjtött mintákban a diazepám és a nordiazepám koncentrációja 7,5 (2,1 ng L-1) és 75 pM (20 ng L-1) volt. Így a nordiazepám koncentrációját körülbelül egy nagyságrenddel magasabbnak határozták meg, mint a diazepámét. Ezek az eredmények összhangban vannak a szennyvízzel kapcsolatos más vizsgálatok eredményeivel. Ezenkívül néhány, a szakirodalomban ismertetett tisztított szennyvízmintában a nordiazepámot számszerűsítették, de a diazepámot nem mutatták ki . A jelen vizsgálatban sem diazepámot, sem nordiazepámot nem mutattak ki a Fyris folyóból, a Kungsängsverket szennyvíztisztító teleptől 3 km-re felfelé gyűjtött felszíni vízben, ami arra utal, hogy a folyásirányban kevés antropogén szennyvízkibocsátás történt.
.