A rekombináns fehérjék oldhatóságának javítása az MBP tag használatával

Források “Technikai erőforrás központok “Fehérje technikai erőforrások “Technikai erőforrások “Technikai Notes “MBP tag

E. Coli expresszió

A rekombináns fehérje előállításához expressziós gazdaszervezetre van szükség, és erre a célra általában az E. coli a legjobb választás. Az egyszerű genetika, a könnyű tenyésztés, a gyors expresszió és a nagy hozam kombinációja teszi vonzó gazdaszervezetté, míg a hatékony poszt-transzlációs gépezet hiánya, a kodonhasználati torzítás és a nagyobb molekulatömegű fehérjék előállításának nehézsége hátrányossá teszi. Az E.coli expresszió egyik legnagyobb baja azonban az oldhatatlan expresszió – az a jelenség, amikor a rekombináns túlexpresszió oldhatatlan fehérjeaggregátumok, úgynevezett zárványtestek képződését eredményezi.

Az inklúziós testek kezelésének és a célfehérje oldhatóságának javításának módjai

Ha inklúziós testek képződnek, a tudósok általában az in vitro fehérje szolubilizációnak és újrahajtogatásnak nevezett nehézkes eljárással próbálkoznak az oldható fehérje visszanyerésére, vagy a folyamat vagy molekuláris szintű expressziós optimalizálással próbálkoznak az oldhatatlansági problémák megelőzésére.

A folyamat szintű optimalizálásra például olyan módszerek tartoznak, amelyek nem igényelnek target engineeringet. Például az expressziós feltételek optimalizálása, a növekedési és indukciós feltételek beállítása, a médiumok, pufferek stb. megváltoztatása. Alternatív megoldás lehet a molekuláris megközelítés kipróbálása és a célfehérje manipulálása a szekvencián belüli nemkívánatos elemek kiküszöbölésével, csonkítások létrehozásával vagy bizonyos aminosavak mutációjával, hogy a fehérje oldhatóbbá váljon. Alkalmazhatna egy racionális, hely-irányított mutagenezis megközelítést is, amely a szerkezeti információkon alapul, vagy alkalmazhatna egy irányított evolúciós megközelítést, és szűrhetné a véletlenszerű pontmutánsok, deléciók és fragmentumok oldhatóságát. Jobb és egyszerűbb megközelítés lenne a fúziós partner stratégiát alkalmazni, és egy olyan upstream fúziós partnert használni, amely a célfehérjét oldhatóbbá teszi.

Fúziós partner megközelítés a fehérje oldhatóságának javítására

Ezzel a megközelítéssel egy nehezen expresszálható fehérjét vagy peptidet egy másik, stabil, jól oldódó fehérjéhez fuzionálnak az expresszió stabilizálása érdekében, azzal az elképzeléssel, hogy a fúziós fehérje fogja irányítani a kapott expressziót. Bár sok fehérje nagymértékben oldódik, nem mindegyik hatékony fehérjeoldékonyság-javítóként. Ebben a tekintetben a maltózkötő fehérje nagyon hasznos fehérjeoldékonysági partner lehet. Egy összehasonlító vizsgálatban, amelynek célja a fehérjeoldékonyság-növelő tulajdonságaik vizsgálata volt, az E. coli MBP tag sokkal hatékonyabb fehérjeoldékonyság-növelő partnernek bizonyult, mint a glutation-S-transzferáz (GST) és a tioredoxin (TRx) fehérjék.

1. ábra: A GenScript tudósainak ajánlása a konstrukciótervezéssel kapcsolatban

Az MBP tagről és hatásmechanizmusáról

Az MBP egy körülbelül 42 kDa, E. coli-ban természetesen előforduló fehérje, amelyet a malE gén kódol, és amely a maltodextrin, egy szénhidrát felvételéért, lebontásáért és szállításáért felelős. Eredetileg fehérje-expressziós címkeként fejlesztették ki az 1980-as években, és ismert, hogy jelentősen növeli számos downstream-fuzionált, célfehérje oldhatóságát. Bár a fehérjék oldhatóságának az MBP tag általi növelésének pontos mechanizmusa nem világos, ismert, hogy a fehérjeszintézis során és azt követően stabilizálja és megvédi a downstream utasfehérjét a proteolitikus degradációtól. Az MBP-vel fuzionált fehérjék citoplazmatikus hozama általában azért is magasabb, mert a fúziós fehérje megbízható kontextust biztosít a hatékony transzlációindításhoz. Azt is feltételezik, hogy az MBP tag chaperonként működhet a felületén lévő, oldószerrel exponált forró ponton keresztüli kölcsönhatások révén, amely stabilizálja az egyébként oldhatatlan utasfehérjét.

Az MBP tag használata

Míg az N- vagy C-terminusra fuzionált MBP tag bizonyítottan növeli a rekombináns szolubilis expressziót, az általános megközelítés az N-terminusra fuzionálás. Sajnos, mivel egyetlen tag sem lehet ideális minden alkalmazáshoz, a tagek és a downstream alkalmazások sokoldalúságának növelése érdekében kombinatorikus tagelési módszereket fejlesztettek ki különböző igényekre. Két, egymás mellett expresszált affinitási címke és a célfehérje előtti proteáz hasítóhely lehetővé teszi többféle tisztítási stratégia alkalmazását. Egy szolubilitást fokozó tag és egy tisztítási tag kombinációjával a fehérje oldhatóságának és expressziós hozamának javítása, valamint a hatékony tisztítás módszerei érhetőek el

2. ábra: A konstrukciótervezési stratégia általános vázlata – az affinitás/oldhatósági tag kombinációja az N-terminuson, a proteolitikus hasítási hely, majd a célfehérje következik, jó eredményeket adhat, különösen oldhatatlan célfehérjék esetében. Egy linker szekvencia gyakran segíthet a proteolitikus hasítás problémáin.

MBP-vel jelölt fehérjék tisztítása

A fehérje oldhatóságának javításán kívül az MBP-fúziós stratégia alkalmazásának másik előnye a downstream célfehérje tisztításának megkönnyítése. Az MBP egy természetes affinitási tag, amely amilózgyantához kötődik, és keresztkötésű amilózhoz kötődve egylépéses affinitástisztításhoz használható. Az immobilizált amilózhoz kötött MBP taggel fuzionált rekombináns fehérjéket általában nem denaturáló körülmények között, maltóz felhasználásával eluáljuk.

Ez a stratégia hátrányai

• A célfehérje hasítása problémát jelenthet az MBP tag sztérikus akadályozása miatt
• Az amilózgyanta törékeny és viszonylag drága lehet
• A célfehérje kicsapódása a hasítás után
• Egyes MBP fúziós fehérjék nem kötődnek hatékonyan az amilózgyantához, és még ha kötődnek is, a hozam problémás lehet

Következtetés

Míg nincs egyszerű, globális megoldás az oldhatatlansági problémák megoldására az E.coli expressziójának megoldására, egy jól kidolgozott konstrukcióval és gondosan kidolgozott expressziós stratégiával elérhető a kívánt oldható fehérje. Az MBP megbízható szolubilitásjelző a rekombináns oldható fehérje előállításához, és bár az oldhatóság a fehérje előállítási kampány egyik legfontosabb eleme, a végcél nem mindig az oldhatóságról kell szólnia. Az expressziós szint, a fehérjeaktivitás, a tisztaság, a homogenitás és a stabilitás mind olyan fontos tényezők, amelyeket szintén figyelembe kell venni, mielőtt egy rekombináns fehérje előállítási kampányba kezdenénk.

Néhány publikáció, amely az MBP tag hasznosságát bizonyítja

Fusokinok előállítása MBP -Maltózzal- felhasználásával.Binding Protein Fusion Allows for High Level Bacterial Expression and Purification of Bioactive Mammalian Cytokine Derivatives (September 2014)

The rescue of aggregation-prone proteins using MBP -Rescuing aggregation-prone proteins in Escherichia coli with a dual His₆-MBP tag (May 2014)

MBP for soluble protein production in E. coli -Hexahisztidinnel jelölt maltózkötő fehérje mint fúziós partner szolubilis rekombináns fehérjék előállításához Escherichia coli-ban (2009)

1. Pryor, K. A., és Leiting, B. (1997). Szolubilis fehérje magas szintű expressziója Escherichia coli-ban His6-tag és maltózkötő fehérje kettős affinitású fúziós rendszer segítségével. Protein Expr. Purif. 10, 309-319
2. Routzahn, K. M. és Waugh, D. S. (2002). Kiegészítő affinitáscímkék differenciális hatása az MBP fúziós fehérjék oldhatóságára. J. Struct. Funct. Genomics 2, 83-92
3. Nallamsetty, S., Austin, B. P., Penrose, K., J. és Waugh, D. S. (2005) Gateway vektorok kombinatorikusan jelölt His6-MBP fúziós fehérjék előállítására az Escherichia coli citoplazmájában és periplazmájában. Protein Sci. 14, 2964-2971
4. Esposito D, Chatterjee DK: Az oldható fehérjék expressziójának fokozása fúziós címkék alkalmazásával. Curr Opin Biotechnol 2006, 17:353-8.184.
5. Peti W, Page R: Strategies to maximize heterologous protein expression in Escherichia coli with minimal cost. Protein Expr Purif 2007, 51:1-10.]
6. Wilkes D.M., Expression and purification of the first nucleotide-binding domain and linker region of human multidrug resistance gene product: comparison of fusions to glutathione S-transferase, thioredoxin and maltose-binding protein. Biochemical Journal 1999, 77-81
7. Fox JD, Kapust RB, Waugh DS: Single amino acid substitutions on the surface of Escherichia coli maltose-binding protein can have a profound impact on the solubility of fusion proteins. Protein Sci 2001, 10:622-630

Bakteriális expressziós projektet tervez? Kérjen ingyenes árajánlatot másodperceken belül a BacPower™ Garantált fehérjeexpressziós csomagjainkra.

Ájánlatok és rendelés

#Automatikus árajánlatot csak akkor készítünk, ha a szekvenciák megfelelnek a Garantált szolgáltatásnak, amint azt saját szekvenciaelemző platformunk meghatározza, ennek hiányában műszaki ügyfélmenedzserünk felveszi Önnel a kapcsolatot egy egyedi fehérje előállítási árajánlattal. Biztos lehet benne, hogy egyedi szolgáltatásaink ugyanolyan magas színvonalúak és versenyképesek, mint a Garantált szolgáltatásaink.

Az ügyfélszolgálati munkatársaink a nap 24 órájában, hétfőtől péntekig állnak az Ön rendelkezésére.