Szignifikancia
Az öregedés pontos okait még mindig nem értjük, és nem világos, hogy egyes fajok miért élnek kevesebb mint 1 d alatt, míg mások több mint 400 y-t. A kutatások szerint a telomerek összefüggésben vannak az öregedési folyamattal, de egyértelmű kapcsolatot nem figyeltek meg egy faj élettartama és a kezdeti telomerhossz között. Itt különböző fajok telomerhosszát mérjük meg. Azt találjuk, hogy valójában nincs szoros összefüggés egy faj élettartama és a kezdeti telomerhossz között. Erős korrelációt találunk azonban a telomerek rövidülési sebessége és egy faj élettartama között.
Abstract
A telomerek kritikus hosszúságúra való rövidülése egerekben és emberekben öregedést és rövidebb élettartamot válthat ki egy olyan mechanizmus révén, amely magában foglalja a kromoszómavégek tartós DNS-károsodási válaszának indukcióját és a sejtek életképességének elvesztését. Nem ismert azonban, hogy a telomerhossz a fajok hosszú élettartamának egyetemes meghatározója-e. Annak megállapítására, hogy a telomerek rövidülése lehet-e egyetlen paraméter a fajok élettartamának előrejelzésére, itt párhuzamosan mértük a legkülönbözőbb, nagyon különböző élettartamú és testméretű fajok (madarak és emlősök), köztük az egér (Mus musculus) telomerhosszát, kecske (Capra hircus), Audouin sirály (Larus audouinii), rénszarvas (Rangifer tarandus), keselyű (Gyps fulvus), palackorrú delfin (Tursiops truncatus), amerikai flamingó (Phoenicopterus ruber) és szumátrai elefánt (Elephas maximus sumatranus). Azt találtuk, hogy a telomerek rövidülési sebessége, de nem csak a kezdeti telomerhossz önmagában, erőteljes előrejelzője a fajok élettartamának. Ezek az eredmények alátámasztják azt az elképzelést, hogy a kritikus telomer-rövidülés és az ebből következő telomer DNS-károsodás és a sejtek öregedése a fajok élettartamának általános meghatározója.
- telomer
- élethossz
- faj
Az emberek viszonylag rövid, 5 és 15 kb közötti telomerhosszal rendelkeznek (1⇓-3), mégis az emberek élettartama sokkal hosszabb, mint az egereké, amelyek 50 kb körüli telomerhosszal indulhatnak (4, 5). Korábbi tanulmányok azt sugallták, hogy nem a kezdeti telomerhossz, hanem a telomer-rövidülés sebessége az a kritikus változó, amely meghatározza a fajok élettartamát (4, 6⇓⇓⇓⇓⇓-10). Korábban kimutattuk, hogy az emberi telomerek ∼70 bp/év sebességgel rövidülnek (1), ami összhangban van a más szerzők által publikált sebességgel (3, 11⇓⇓⇓-14), míg az egér telomerek 7000 bp/év sebességgel rövidülnek (4). A telomerek rövidülésének ez az eltérő sebessége az ember és az egerek között magyarázatot adhat az egerek és az emberek eltérő élettartamára. A telomerek rövidülési sebességét azonban eddig kevés fajnál vizsgálták (4, 6⇓⇓⇓⇓-10, 15, 16), és különböző technikákkal, ami megakadályozta a telomerek rövidülési sebességének egymás melletti összehasonlítását filogenetikailag távoli, eltérő testmérettel és élettartammal rendelkező fajoknál.
Azzal a kérdéssel kapcsolatban, hogy a telomerhossz és/vagy a telomerrövidülési ráta magyarázhatja-e a fajok hosszú élettartamát, párhuzamosan megmértük a telomerhosszat különböző madár- és emlősfajok különböző életkorú egyedeinek perifériás vér mononukleáris sejtjeiben, és kiszámítottuk az egyes fajok telomerrövidülési rátáját évenként. A telomerhossz longitudinális vizsgálatát itt nem vettük figyelembe a vizsgálatba bevont fajok nagyon eltérő élettartama miatt. A jövőbeni tanulmányok indokolják az ilyen típusú elemzést a telomerek dinamikájának megértéséhez az egyedek szintjén. A telomerhossz mérésére itt egy nagy áteresztőképességű kvantitatív fluoreszcens in situ hibridizációs (HT Q-FISH) technikát használtunk, amely lehetővé teszi az egyedi telomerjelek számszerűsítését egysejtes szinten (1), és mind az átlagos telomerhosszra, mind az egyedi telomerjelekre vonatkozó adatokat szolgáltat (SI Függelék, S1 táblázat és 1. ábra) (17, 18). Különösen laboratóriumi egerek (Mus musculus) (1A. ábra), palackorrú delfinek (Tursiops truncatus) (1B. ábra), kecskék (Capra hircus) (1C. ábra), rénszarvasok (Rangifer tarandus) (1B. ábra) telomerjeit mértük párhuzamosan. 1D), amerikai flamingók (Phoenicopterus ruber) (1E ábra), keselyűk (Gyps fulvus) (1F ábra), Audouin sirályok (Larus audouinii) (1G ábra) és szumátrai elefántok (Elephas maximus sumatranus) (1H ábra). Kontrollként laboratóriumi egereket vontunk be, mivel korábban kimutattuk, hogy a telomerek rövidülésének sebessége körülbelül 7000 bp/év, ami 100-szor gyorsabb, mint az embereknél tapasztalt érték (4). A különböző vizsgált fajok kezdeti telomerhosszát lineáris regresszióval becsültük meg (1. ábra). Megjegyzendő, hogy a kezdeti telomerhossz érték csak becslés, és a telomerhossz dinamikája nem feltétlenül lineáris az élet korai szakaszában (19). Először is megerősítettük a telomer-rövidülés nagyon magas, 6 420 bp/év sebességét a jelenlegi egérkohorszunkban (1A. ábra), hasonlóan az általunk korábban leírtakhoz (4). A palackorrú delfineknél 766 bp/év telomer-rövidülési arányt (SI Függelék, S1 táblázat és 1B ábra) és 90,7 kb körüli becsült kezdeti telomerhosszúságot mutattak (1B ábra). A kecskéknél 363 bp/év telomer-rövidülési arányt (1C. ábra) és 10,4 kb körüli becsült kezdeti telomerhosszúságot mutattak ki. A rénszarvasoknál a telomer rövidülési aránya 531 bp/év volt (1D. ábra) és a becsült kezdeti telomerhossz ∼ 19,8 kb. Az amerikai flamingóknál 105 bp/év telomer-rövidülési arányt (1E ábra) és 21,0 kb körüli becsült kezdeti telomerhosszúságot mutattak ki. A griffmadaraknál a telomer rövidülési aránya 209 bp/év volt (1F. ábra) és a becsült kezdeti telomerhossz 19,8 kb körül volt. Az Audouin sirályok telomer-rövidülési aránya 771 bp/év volt (1G ábra) és a becsült kezdeti telomerhossz 35 kb körül volt. A szumátrai elefántok telomer-rövidülési rátája 109 bp/év (1H ábra) és a becsült kezdeti telomerhossz 36,3 kb körüli. A griffmadarak és a szumátrai elefántok esetében a madridi állatkertben rendelkezésre álló kevés egyedre szorítkoztunk; így ezekben az esetekben a kapott értékeket első közelítésnek kell tekinteni az e fajok telomer-rövidülési sebességére vonatkozóan.
Telomer mérések különböző fajok esetében. A telomerek mérése HT Q-FISH segítségével történt különböző korú egyedeknél (A) egerek (Mus musculus), (B) palackorrú delfinek (Tursiops truncatus), (C) kecskék (Capra hircus), (D) rénszarvasok (Rangifer tarandus) esetében, (E) amerikai flamingók (Phoenicopterus ruber), (F) griffmadarak (Gyps fulvus), (G) Audouin sirály (Larus audouinii) és (H) szumátrai elefántok (Elephas maximus sumatranus). Az egyes pontok egy-egy egyed értékeit mutatják. A korrelációs együttható (R2), a meredekség (a telomerek rövidülési sebessége kilobázisban/év) és az y metszéspont (kezdeti telomerhossz) a grafikonokon látható.
A következőkben a telomerhossz, a telomerek rövidülési sebessége és a fajok élettartama közötti összefüggéseket vizsgáltuk. A fajok maximális élettartamához az AnAge adatbázist (20) használtuk. Az átlagos élettartamokat különböző forrásokból szereztük be (SI Függelék, S1 táblázat). Először is, nem találtunk összefüggést a becsült kezdeti telomerhossz és a fajok élettartama között (2. ábra A-D). Különösen, a fajok maximális élettartamának és a becsült kezdeti telomerhossznak a grafikonja 0,0190-es R2 értéket eredményezett lineáris regressziós görbével (2A. ábra), és 0,0407-es R2 értéket power law regressziós görbével (2B. ábra). A fajok átlagos élettartamának grafikonja a becsült kezdeti telomerhosszal szemben 0,125-ös R2 értéket eredményezett lineáris regressziós görbével (2C. ábra), és 0,145-ös R2 értéket power law regressziós görbével (2D. ábra). Megjegyzendő, hogy még az imént említett alacsony R2 értékekkel és a regressziós egyenesek egyenleteinek negatív meredekségével (2. ábra A-D) még a hosszabb kezdeti telomerhosszúságok esetén is a rövidebb élettartam tendenciája figyelhető meg. Figyeljük meg azt is, hogy az átlagos élettartam és a kezdeti telomerhossz közötti fordított korreláció (R2 = 0,125; 2C ábra) jobb volt, mint a maximális élettartam és a kezdeti telomerhossz közötti (R2 = 0,019; 2A ábra). Ezek az eredmények összhangban vannak egy korábbi vizsgálattal, amely több mint 60 különböző faj telomerhosszát hasonlította össze (21). Bár a telomerek rövidülési sebességét nem mérték ebben a vizsgálatban, a szerzők arra a következtetésre jutottak, hogy egy faj élettartama nem jósolható meg a kezdeti telomerhosszból, és hogy a rövid életű fajok esetében tendencia, hogy a telomerek hosszabbak (21).
A fajok élettartamának előrejelzése a telomer paraméterekkel I. (A) Maximális élettartam függvénye a becsült kezdeti telomerhossz függvényében, lineáris regressziós egyenessel illesztve. (B) Maximális élettartam vs. becsült kezdeti telomerhossz illesztése hatványtörvényes regressziós egyenessel. (C) Átlagos élettartam vs. becsült kezdeti telomerhossz lineáris regressziós egyenessel való illesztése. (D) Átlagos élettartam vs. becsült kezdeti telomerhossz illesztése hatványtörvényes regressziós egyenessel. (E) Maximális élettartam vs. telomer-rövidülés mértéke. (F) A megjósolt élettartam vs. a maximális élettartam. A megjósolt élettartamot a telomer-rövidülési ráta felhasználásával számoltuk ki az E-ből vett hatványtörvényes regressziós egyenletben. (G) Átlagos élettartam vs. telomer-rövidülési ráta. (H) A megjósolt élettartam vs. az átlagos élettartam. Az előre jelzett élettartamot a telomer-rövidülési ráta felhasználásával számoltuk ki a G-ből származó hatványtörvényszerű regressziós egyenletben.
Érdekes, hogy amikor a különböző fajok maximális élettartamát ábrázoltuk a telomer-rövidülési ráta függvényében, 0,829-es R2 értékű hatványtörvényszerű görbét kaptunk (2E ábra). Ennek a görbének az egyenlete felhasználható egy faj élettartamának előrejelzésére, ha adott a telomer-rövidülés sebessége anélkül, hogy bármilyen információt használnánk a kezdeti telomerhosszra vonatkozóan, 0,782-es R2 értékkel (2F ábra). Ugyanezek a grafikonok elkészíthetők a maximális élettartam helyett az átlagos élettartamot használva (2. ábra G és H), és ebben az esetben a hatványtörvénygörbe R2 értéke 0,934. Az a megfigyelés, hogy az élettartam és a teloméra-rövidülés aránya hatványtörvénygörbére illeszkedik, összhangban van számos olyan természeti jelenséggel, amely vagy hatványtörvényre, vagy exponenciális görbére illeszkedik, mint például a népességnövekedés, a hőmérséklet lehűlése/felmelegedése, a városok mérete, a fajok kihalása, a testtömeg, az egyéni jövedelmek és a csomópontokhoz tartozó kapcsolatok száma egy skálamentes hálózatban, többek között (22⇓⇓-25).
Alternatívaként lineárisabb élettartam-előrejelzéseket lehet készíteni mind a kezdeti telomerhossz, mind a telomer-rövidülés mértéke alapján. Ebben az esetben valószínűtlennek tűnik, hogy a fajok akkor pusztulnak el, amikor a telomereik teljesen leépülnek, mivel a teljes telomererózióval megjósolt élettartam hosszabb, mint a legtöbb faj esetében megfigyelt élettartam (SI Függelék, S1 táblázat). Ehelyett itt azt találjuk, hogy a telomerek hossza, amikor a fajok a maximális élettartam korában halnak meg, az adott faj eredeti telomerhosszának ∼50%-ának tűnik, ha az összes mért faj átlagát tekintjük (SI Függelék, S2 táblázat). Érdekes módon, ha az átlagos élettartam időpontját vesszük figyelembe, a telomerhossz az eredeti hossz ∼75%-ának tűnik (SI Függelék, S2 táblázat). Ezért kiszámíthatjuk egy faj élettartamát, ha feltételezzük, hogy a telomerek állandó lineáris sebességgel rövidülnek, és a halál időpontja akkor következik be, amikor a telomerek az eredeti telomerhossz 50%-ára vagy 75%-ára rövidülnek. A becsült élettartam egyenlete, ha a telomerek az eredeti hossz 50%-ára rövidülnek, a következő: ((Kezdeti telomerhossz) – (Kezdeti telomerhossz) × 0,5)/Telomer-rövidülési ráta. Az 50%-os eredeti telomerhossz mellett becsült élettartam és a maximális élettartam ábrázolása 0,565-ös R2-t eredményez (3A ábra). A becsült élettartam 50%-os eredeti telomerhossz mellett és az átlagos élettartam között az R2 értéke 0,694 (3B. ábra). Hasonló grafikonokat mutatunk be a 75%-os eredeti telomerhosszra (3. ábra C és D). Ennél az adatkészletnél a 75%-os eredeti telomerhosszúság vs. az átlagos élettartam grafikon adja a legpontosabb eredményeket 0,694-es R2-vel. Bár az R2 érték megegyezik a 3B. ábrán látható értékkel, ennek a grafikonnak a meredeksége is közelebb van az 1 értékhez, ami kisebb elmozdulást jelez a tényleges és a becsült élettartam között. Megjegyezzük, hogy jobb korrelációs együtthatókat kapunk a hatványtörvényszerű regressziós görbékkel, amelyek a telomerek rövidülési sebességét használják a kezdeti telomerhossz figyelembevétele nélkül (2. ábra E-H).
A fajok élettartamának előrejelzése a telomer paraméterekkel II. (A) A becsült élettartam, ha a telomerek az eredeti hossz 50%-ára rövidülnek, vs. a maximális élettartam. (B) A becsült élettartam, ha a telomerek az eredeti hossz 50%-ára rövidülnek az átlagos élettartamhoz képest. (C) A becsült élettartam, ha a telomerek az eredeti hossz 75%-ára rövidülnek, a maximális élettartamhoz képest. (D) A becsült élettartam, ha a telomerek az eredeti hossz 75%-ára rövidülnek az átlagos élettartamhoz képest. A becsült élettartamot a következő egyenlet segítségével kell kiszámítani: (“Telomerhossz eredeti” – “Eredeti telomerhossz” × “az eredeti hossz százalékában”)/”Telomer-rövidülési arány”. (E) Grafikus illusztráció, amely a tanulmány fő megállapítását mutatja, vagyis azt, hogy a gyorsabb telomer-rövidülési ráta rövidebb faji élettartamot eredményez.
Egy másik tulajdonság, amely korrelál az élettartammal, a testtömeg (26). Általában a nagyobb testű fajok, például az elefántok és a bálnák élettartama hosszabb, mint a kisebb testű fajoké, például az egereké és a nyulaké. Egy vizsgálat 1456 különböző faj testtömegét és élettartamát hasonlította össze, és azt a tendenciát találta, hogy a nagyobb testtömeggel hosszabb az élettartam (R2 = 0,397) (26). A mi adathalmazunkban szereplő fajok esetében szintén korrelációt figyeltünk meg a tömeg és az élettartam között (SI Függelék, S3. táblázat). A fajok telomer-rövidülési aránya szintén korrelált a testtömeggel, az R2 értéke 0,413 volt (SI Függelék, S1 ábra). A nagyobb testtömegű fajok általában alacsonyabb telomer-rövidülési rátával és hosszabb élettartammal rendelkeznek.
Egyes szerzők fordított korrelációt mutattak ki az élettartam és a szívfrekvencia, a szervezet anyagcseréjével kapcsolatos változó között (27, 28), bár szélesebb körű vizsgálatok nem látszanak alátámasztani ezt az elképzelést (29). Itt a szívfrekvencia és a telomerhossz közötti lehetséges összefüggés vizsgálatát tűztük ki célul. Először is korrelációt figyeltünk meg az élettartam és a pulzusszám között a mi adatállományunkkal (SI Függelék, S3 táblázat). A telomer-rövidülés mértéke és a pulzusszám között is lineáris korrelációt találtunk, amelynek R2 értéke 0,974 volt (SI Függelék, S2 A és B ábra).
Ezután, hogy megvizsgáljuk a több változó élettartamra gyakorolt hatását, ha ugyanabban a modellben kombináljuk, többváltozós lineáris regressziót végeztünk. A telomer-rövidülési sebesség, a kezdeti telomerhossz, a testtömeg és a pulzusszám bemeneti változókat vagy az átlagos élettartamra, vagy a maximális élettartamra illesztették. A regresszióhoz használt adatokat az SI Függelék S4. táblázata tartalmazza. A regresszióhoz az összes adatpont logaritmikus értékét használtuk az eredeti értékek helyett. Az egyes változók az átlagos élettartam vagy a maximális élettartam függvényében vagy magasabb lineáris R2 korrelációs együtthatót mutattak a log-transzformált adatok használata esetén, vagy a kezdeti telomerhossz változó esetében nem volt észrevehető változás a korrelációs együtthatóban. Az átlagos élettartamra illesztett modell 0,997-es R2 értéket és 0,992-es korrigált R2 értéket eredményezett (SI Függelék, S5. táblázat), ami azt mutatja, hogy ezek a változók képesek megjósolni az átlagos élettartamot. A P-értékek (a Pr(>|t|) oszlopban felsoroltak) minden változó esetében statisztikailag szignifikánsak voltak. A telomerek rövidülési aránya volt a statisztikailag legjelentősebb változó (P = 0,000422). A maximális élettartamra illesztett modell 0,950-es R2 értéket és 0,884-es korrigált R2 értéket eredményezett (SI Függelék, S6. táblázat), ami azt mutatja, hogy a változók a maximális élettartamot is képesek megjósolni. Ebben az esetben csak a telomer-rövidülés mértéke változó volt statisztikailag szignifikáns (P = 0,0218). Ismét fordított kapcsolatot találtunk az átlagos élettartam és a kezdeti telomerhossz között P = 0,0302 P-értékkel, a rövid életű fajok kezdeti telomerhossza hosszabb volt (SI Függelék, S5. táblázat). A többváltozós elemzésben a kezdeti telomerhossz és a maximális élettartam közötti kapcsolat szintén nem volt szignifikáns, összhangban a kezdeti telomerhossz és a maximális élettartam közötti gyengébb inverz korrelációval az átlagos élettartamhoz képest (2. ábra A és C). Ezek az eredmények tehát megerősítik, hogy a telomer-rövidülés mértéke (negatív korreláció), a kezdeti telomerhossz (negatív korreláció), a testsúly (pozitív korreláció) és a szívfrekvencia (negatív korreláció) képes megjósolni a fajok élettartamát, és hogy e változók közül a telomer-rövidülés mértéke az a változó, amelynek a legnagyobb ereje van az élettartam előrejelzésére.
Végezetül, a különböző korú állatokkal végzett vizsgálatok egyik fenntartása, hogy előfordulhat olyan hatás, hogy a rövid telomerekkel rendelkező idős állatok szelektíven eltűnnek a halál miatt, és ezek a telomerek következésképpen nem mérhetők meg idősebb korban. Ezért a telomerhossz mesterségesen magas lehet az idősebb korokban, mivel csak a hosszabb telomerekkel rendelkező állatok maradnak életben ezekben az életkorokban. Az a tény azonban, hogy a telomerek életkorral való rövidülése a vizsgált fajok többségénél lineáris regresszióba illeszkedik, azt jelezte, hogy ez a jelenség nem nagyon torzít a jelenlegi vizsgálatunkban. Emellett az állatok ilyen eltűnése csak nagyon késői életkorban lenne várható, és a jelen vizsgálatban szereplő állatok többsége nem volt rendkívül idős (Módszerek).
Következtetések
Noha számos korábbi tanulmány mérte a telomerek hosszát különböző fajokban (30⇓⇓⇓⇓-35), közülük kevés határozta meg a telomerek rövidülési sebességét (4, 6⇓⇓⇓⇓-10, 15, 16). E tekintetben néhány tanulmány összefüggést talált a telomerek rövidülési rátája és a fajok élettartama között, beleértve a mi csoportunk korábbi munkáit egereken és embereken (1, 4, 6⇓⇓⇓⇓-10); ezek a tanulmányok azonban nem hasonlították össze egymás mellett a telomerek rövidülési rátáját filogenetikailag távoli fajoknál, egyetlen technikát használva a telomerek mérésére.
Jelen tanulmányunkban több, egymástól nagyon eltérő élettartamú faj, köztük madarak és emlősök telomerhosszát és telomerrövidülési sebességét mértük ugyanabban a laboratóriumban az érzékeny HT Q-FISH technikával, amely lehetővé teszi az abszolút telomerhossz értékek bázispár egységben történő meghatározását, valamint az egyes telomer jelek meghatározását. A jelenlegi vizsgálat korlátja azonban az, hogy néhány faj esetében kevés egyed állt rendelkezésre.
Az itt bemutatott eredmények azt mutatják, hogy egy faj telomer-rövidülési sebessége felhasználható az adott faj élettartamának előrejelzésére, legalábbis a jelenlegi adatsorral (3E. ábra). Megfigyeltük, hogy a születéskori átlagos telomerhossz nem korrelál a faj élettartamával, mivel sok rövid életű fajnak nagyon hosszú telomerjei, a hosszú életű fajoknak pedig nagyon rövid telomerjei voltak. A jövőbeni vizsgálatok indokolttá teszik a telomerek rövidülési sebességének meghatározását olyan fajoknál, mint a meztelen patkány vagy a denevér, amelyek testméretük alapján megjósolt élettartamuknak nem felelnek meg jól (26, 36).
Végezetül, az a tény, hogy a telomerek rövidülési sebessége felhasználható az élettartam előrejelzésére, arra utal, hogy a rövid telomerek által kiváltott sejtes hatások, például a sejtek öregedése lehet a fajok hosszú élettartamát meghatározó kritikus tényező. Ebben a tekintetben egyes tanulmányok a DNS-javító képességet a fajok élettartamával hozzák összefüggésbe (37⇓-39). Különösen az UV-indukált károsodások javításának képessége korrelál pozitívan az élettartammal különböző fajoknál, beleértve a főemlősöket is (37, 38). Emellett a DNS-javítási arányok magasabbak a hosszabb életű rágcsálófajoknál, mint a rövidebb élettartamú rágcsálófajoknál (39). Érdekes megjegyezni, hogy a rövid telomerek DNS-károsodást indukálnak, és viszont bizonyos típusú DNS-károsodások, mint az UV-sugárzás vagy az oxidatív stressz, szintén a telomerek rövidüléséhez vezethetnek (40⇓-42).
Módszerek
Egerek.
Az egértörzs >95% C57BL/6 háttér volt. Minden egeret a spanyolországi Madridban található Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO) intézmény specifikus-patogénmentes gátján tenyésztettek és tartottak. Az elválasztás után ketrecenként 5 egeret helyeztünk el, és ad libitum nem tisztított, sterilizálható Teklad 2018 18%-os fehérjetartalmú rágcsálótáppal (Harlan; TD.2018S) etettük. Minden állatkísérleti eljárást a CNIO-Instituto de Salud Carlos III Kutatási és Állatjóléti Etikai Bizottsága hagyott jóvá, és az Európai Laborállat-tudományi Egyesületek Szövetségének ajánlásai szerint végeztük.
Vérminták.
A vérmintákat a madridi állatkertből nyertük, kivéve az egérmintákat, amelyeket a CNIO állattartó létesítményéből és az Audouin sirályokból nyertünk. Minden egyednél csak 1 időpontot mértünk, így ez egy keresztmetszeti vizsgálat. Az egerek (Mus musculus) esetében 7 egyedtől vettek vérmintát, amelyek életkora 1,4 és 2,6 év között volt. A delfinek (Tursiops truncatus) esetében 9 egyedtől vettek vérmintát, amelyek életkora 8,6 és 50,1 év között volt. Kecskék (Capra hircus) esetében 15 egyedtől vettek vérmintát, amelyek életkora 0,85 és 10,1 év között változott. Rénszarvasok (Rangifer tarandus) esetében 8 egyedtől vettek vérmintát, amelyek életkora 1,44 és 10,5 év között változott. Az amerikai flamingók (Phoenicopterus ruber) esetében 17 egyedtől vettek vérmintát, amelyek életkora 0,79 és 38,8 év között változott. A keselyű (Gyps fulvus) esetében 6 egyedtől vettek vérmintát, amelyek életkora 8,06 és 21 év között változott.A szumátrai elefántfaj (Elephas maximus sumatranus) esetében 4 egyedtől vettek vérmintát, amelyek életkora 6,14 és 24,7 év között változott. Ennél az Audouin sirályfajnál 21 egyedtől (néhány hónapos kortól 21,9 éves korig) vettek vérmintát, amelyeket a polyvinil-klorid gyűrűs címkék alapján történő kormeghatározás után választottak ki. A vérmintákat erythrocyte lysis pufferrel (Qiagen; katalógusszám: 79217) dolgoztuk fel a gyártó protokollja szerint. Ezért minden faj esetében a telomereket a leukocita sejtekben mértük. A mintákat ezután -80 °C-on lassan lefagyasztottuk egy Nalgene Cryo Freezing Containerben (Nalgene; katalógusszám: 5100-0001).
HT Q-FISH.
A HT Q-FISH folyamatát korábban már leírtuk (1). Röviden, a fagyasztott eritrocita lízispufferrel feldolgozott vérmintákat először gyorsan felolvasztottuk és teljes RPMI médiában reszuszpendáltuk. A sejteket a 0,001%-os (wt/vol) poli-l-lizin oldattal (Sigma; P8920-100 ml) előzetesen bevont, tiszta aljú, fekete falú, 96 lyukú lemezek (Greiner Bio-One, Inc.; katalógusszám: 655087) lyukaiba (30 000-150 000 sejt/lyuk) helyeztük 30 percre 37 °C-on. A lemez külső szélén lévő lyukakat nem használtuk. A sejteket a fixálás előtt legfeljebb 4 órán át 37 °C-on inkubáltuk. A sejteket úgy fixáltuk, hogy 200 μL fixáló oldatot (3:1 metanol/ecetsav) adtunk lassan a sejtekhez vegyszerelszívóban, és 10-15 percig inkubáltuk. Az oldatot eltávolítottuk, és ezt még 3 alkalommal megismételtük. Ezután a lemezt egy éjszakán át -20 °C-on fixáltuk, miközben a fixáló oldat a lyukakban volt.
A fixáló oldatot ezután eltávolítottuk, és a lemezt 37 °C-on 1 órán át vegyszerelszívóban forró lemezen szárítottuk. A mélyedéseket 200 μL PBS-szel rehidratáltuk. A sejteket 200 μL 4%-os formaldehiddel PBS-ben 2 percig szobahőmérsékleten (RT) fixáltuk. A lemezt 3 × 5 percig mostuk PBS-szel. A sejtfalakat előmelegített pepszinoldattal (100 ml H2O, 100 μL 37%-os HCl és 100 mg pepszin ) 15 percig 37 °C-on lebontottuk. A lemezt 2 × 5 percig 200 μL PBS-szel mostuk, majd 5 perces 70%-os, 90%-os és 100%-os etanolos mosások sorozatával dehidratáltuk. A lemezt 1 órán át 37 °C-on vagy egy éjszakán át RT-n szárítottuk.
Ezután 50 μL Tel-Cy3 PNA szondát tartalmazó hibridizációs oldatot adtunk a lemezhez (95 μL 1 M Tris, pH 7,0, 812 μL MgCl2 oldat , 6,65 mL deionizált formamid, 475 μL blokkoló reagens , 1,28 mL H2O és 190 μL Tel-Cy3 PNA szonda oldat ). A DNS-t denaturáltuk a lemez 85 °C-on történő 5 perces melegítésével. Ezután a lemezt 2 órán át RT-n inkubáltuk sötétben, majd 15 percig mossuk lemezrázóval 1 mL 1 M Tris, pH 7, 1 mL 10% BSA-t, 28 mL H2O-t és 70 mL formamidot tartalmazó oldattal, majd 2 × 5 percig mossuk lemezrázóval TBST-vel (TBS 0,08% Tween 20-mal). Ezután a lemezt 1 × 5 percig mostuk 1 μg/ml DAPI-t (4′,6-diamidino-2-fenilindol, dihidroklorid; Life Technologies; katalógus sz. D-1306) a sejtmagok festéséhez. Ezután a lemezt 1 × 5 percig PBS-szel mostuk, majd 50 μL Mowiol-oldatot (10 g Mowiol , 25 mL 85%-os glicerin, 25 mL H2O, 12 mL 0,2 M Tris HCl, pH 8,5 és 2,5% DABCO biciklooktán; Sigma-Aldrich; katalógusszám. D27802-25G]) adtuk hozzá. A lemezeket ezután alumíniumfólia fedővel (Beckman Coulter; katalógusszám: 538619) lezártuk, és 4 °C-on, sötétben tároltuk. A lemezeket ezután 48 órán belül HT mikroszkópiával dolgoztuk fel a HT mikroszkópia című fejezetben leírtak szerint.
HT mikroszkópia.
A képeket egy Opera High Content Screening System (PerkinElmer) UV-lámpával, 561 nm-es lézerrel és 40×/0,9 N.A. vízimmersziós objektívvel felszerelt berendezéssel készítettük. A képeket az Acapella Image elemző szoftverrel (PerkinElmer) elemeztük. Az adatokat a Microsoft Excel (Microsoft) programmal elemeztük. A telomerek fluoreszcenciaértékeit külső kalibrálással, a CCRF-CEM (7,5 kb), L5178Y-S (10,2 kb) és L5178Y-R (79,7 kb) sejtvonalakkal (43, 44) kilobázisra konvertáltuk (43, 44).
A nagyon idős egyedek száma a különböző fajokban.
A nagyon idősnek az egyes fajok esetében a maximális élettartam 70%-a feletti értéket tekintettük. Az ember esetében ez 122,5 × 0,7 = 73,5 éves kornak felel meg. Vizsgálatunkban az egyes fajok esetében a mintába vett idős egyedek száma (a maximális élettartam 70%-át meghaladó életkor) a következő: 0/7 (0%) egereknél, 3/8 (37,5%) delfineknél, 0/15 (0%) kecskéknél, 0/8 (0%) rénszarvasoknál, 0/16 (0%) amerikai flamingóknál, 0/6 (0%) keselyűknél, 3/21 (14.3%) az Audouin sirály esetében, és 0/4 (0%) a szumátrai elefánt esetében.
Adatok elemzése.
A grafikonok elkészítése és az adatok elemzése Microsoft Excelben történt. A többváltozós lineáris regressziót az R statisztikai szoftverben végeztük (45).
Köszönet
Köszönjük a madridi állatkertnek a sok segítséget és a különböző fajok vérmintáinak biztosítását. Köszönjük továbbá a Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO) (vagy “Spanyol Nemzeti Rákkutató Központ” Madridban, Spanyolországban) konfokális mikroszkópos magjának és állattartó létesítményének, különösen Rosa Serranónak minden segítségét és támogatását, valamint a CNIO Bioinformatikai Osztályának, különösen Kevin Troulé Lozanónak az elemzésben nyújtott segítségét. Köszönetet mondunk az Ebro Delta Természeti Park személyzetének és M. García-Tarrasónnak a terepmunka során végzett mintavételért és létesítményekért. Köszönjük továbbá Dr. Dani Oro (Centre d’Estudis Avançats de Blanes-Consejo Superior de Investigaciones Científicas) segítségét a gyűrűzött Audouin sirályok életkorának meghatározásában. Részleges finanszírozást a CGL2016-80963-R projekt (Ministerio Economía, Industria y Competividad) nyújtott. Köszönjük továbbá Paula Martineznek a kézirat átdolgozásában nyújtott segítségét. A M.A.B. laboratóriumában végzett kutatásokat a spanyol Gazdasági és Versenyképességi Minisztérium projektjei (SAF2013-45111-R és SAF2015-72455-EXP), a Comunidad de Madrid projekt (S2017/BMD-3770), a World Cancer Research Project (16-1177) és a Fundación Botín (Spanyolország) támogatta.
Lábjegyzetek
- ↵1Kinek lehet címezni a levelezést? Email: mblasco{at}cnio.es.
-
A szerzői hozzájárulások: K.W. és M.A.B. tervezte a kutatást; K.W., E.V., E.M.-N. és C.S. végezte a kutatást; E.M.-N. és C.S. új reagensekkel/analitikai eszközökkel járult hozzá; E.V. elemezte az adatokat; és K.W. és M.A.B. írta a cikket.
-
Interdekütközési nyilatkozat: M.A.B. alapítója és tulajdonosa a Life Length SL biotechnológiai vállalatnak, amely telomerhossz-méréseket forgalmaz biogyógyászati felhasználásra.
-
Ez a cikk egy PNAS Direct Submission.
-
Ez a cikk támogató információkat tartalmaz online a www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1902452116/-/DCSupplemental oldalon.
.