Az in vitro myoblasztfúzió elemzése és számszerűsítése a LADD multiple stain segítségével

A felnőtt vázizomszövet tartalmaz egy prekurzor sejtpopulációt, az úgynevezett szatellit sejteket, amelyek a vázizomzat javításáért felelősek (1-3). Az aktivált szatellit sejtek (myoblasztok) az izomsérülés helyére vándorolnak, ahol proliferálnak, differenciálódnak és többmagvú myotubusokká fuzionálnak (3-5). E folyamat végső sikere azon mérhető, hogy a rezidens myoblastok mennyire fuzionáltak a terminális differenciálódás során.

A myoblastfúzió in vitro kísérleti értékeléséhez a fúziós indexet az immunfluoreszcencia mikroszkópos kimutatásán alapuló fúziós indexet számítják ki. Fluoreszcensen jelölt antitesteket használnak az izomrostok szerkezeti fehérjéinek, például a miozin nehézlánc (MyHC) és a desmin kimutatására, vagy alternatívaként fluoreszcensen jelölt falloidin használható az F-aktin vizualizálására (6-9). A sejtmagokat fluoreszcens módon jelöljük egy DNS-kötő vegyület, például a Hoechst 33258 segítségével. Ezt követően vagy a ≤3 sejtmaggal rendelkező myocitákban lévő sejtmagok százalékos arányát (9) vagy a MyHC-pozitív myotubusokban lévő sejtmagok százalékos arányát (10) kell kiszámítani. Ezek a megközelítések jól beváltak; azonban kiterjedt, időigényes optimalizálást igényelnek a kívánt antigén erős és specifikus jelének előállításához és az azt követő fúziós elemzéshez. Ha fluoreszcensen jelölt antitesteket használnak, a fluoreszcens mikroszkóphoz való hozzáférés további követelmény, amely nem minden intézményben áll rendelkezésre. Az ezt követő kvantitatív meghatározás számos látómező fáradságos és időigényes elemzését igényli, hogy a populációra reprezentatív fúziós indexet kapjunk. Ezek a korlátok, valamint az antitest-alapú vizsgálatok relatív költségei arra ösztönöztek bennünket, hogy egy gyors, költséghatékony in vitro vizsgálatot dolgozzunk ki a myoblastfúzió mennyiségi meghatározására a széles körben elérhető LADD Multiple Stain segítségével.

A LADD Multiple Stain (11) egy kombinált nukleáris és citoplazmatikus festék, amely fukszint és toluidinkéket tartalmaz (Cat. #70955; LADD Research Industries, Williston, VT). Vizsgálatainkhoz friss LADD-t készítünk, amely 0,365 g toluidinkéket (Cat. #89640-5G; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) és 0,135 g fukszint (Cat. #47860-25G; Sigma- Aldrich) tartalmaz 50 ml 30%-os etanolban. Az oldatot oldódásig keverjük, majd Whatman (4-es számú) szűrőpapíron (Cat. #09-825B, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) keresztül szűrjük. A LADD festék műanyag vagy üvegedényben szobahőmérsékleten tárolható és újra felhasználható. A festendő sejteket foszfáttal pufferelt sóoldattal (PBS) mossuk, majd 70%-os etanolban 10 percig fixáljuk. Az etanolt eltávolítjuk, és 500 µl LADD festéket adunk hozzá, biztosítva a sejtek teljes fedettségét. A sejteket 1 percig inkubáljuk, majd a festéket eltávolítjuk, és a sejteket ismételten desztillált vízzel mossuk, amíg a LADD ki nem oldódik a vízbe. Ezután a sejteket hagyjuk megszáradni, és szobahőmérsékleten tároljuk a fáziskontrasztos fénymikroszkópiás vizsgálatig. A megvilágítás javítása érdekében a festett sejteket PBS-be lehet meríteni.

Azért, hogy megállapítsuk, sikeresen használható-e ez a festék a myoblastfúzió vizualizálására, C2C12 sejteket 80%-os konfluenciáig növesztettünk (1A. ábra) standard tenyésztési körülmények között (12). Ezután a médiumot 2% lószérumot tartalmazó differenciáló médiumra cseréltük, ami myotubusokká való fúzióhoz vezetett (1B ábra). A sikeres differenciálódást a MyHC fokozott expressziója (1D. ábra) igazolta a differenciálatlan sejtekhez képest (1C. ábra). A LADD festést követően a differenciálatlan C2C12 mioblasztok világos lila citoplazmát és sötétebb sejtmagot mutatnak (1E ábra; nyíl). A differenciálódást követően azonban a miotubuszok citoplazmája sötétlila színű (1F ábra; nyílhegyek), míg a világosabb sejtmagok jól láthatóak a többmagvú sejteken belül (1F ábra; nyíl). Ezért a LADD többszörös festést követően egyértelműen meghatározott sejtmagok figyelhetők meg, és ugyanolyan könnyen megkülönböztethetők a multinukleált myotube citoplazmájától (1F ábra), mint az immuncitokémiát követő fluoreszcens mikroszkópiával vizsgálva (1D ábra).

Hogy megállapítsuk, hogy a képelemzés használható-e a myoblastfúzió előrehaladásának mérésére, a C2C12 sejteket 6 napig differenciáltuk, és a LADD-vel festett sejtekről 200×-os nagyítással képeket készítettünk Olympus CKX41 inverz fénymikroszkóppal (Olympus Corporation, Tokió, Japán). A várakozásoknak megfelelően a fuzionáló miociták és miotubusok száma egyértelműen nőtt minden további differenciálódási napon (2A. ábra). Ezután kiszámítottuk a fúziós indexet, és a differenciálódó mioblasztok fúziós indexe fokozatosan nőtt 0,45%-ról (1. nap) 31,4%-ra (6. nap) (2B. ábra). Az így kapott fúziós index kedvezően hasonlítható össze a standard immuncitokémia (a MyHC kimutatására) és a nukleáris festés segítségével számított indexszel (13). Annak megállapítására, hogy az ImageJ elemző szoftver (https://imagej.nih.gov/ij/) adaptálható-e a myofiberek területének (mint a fúzió mértékének) számszerűsítésére, egy makrót fejlesztettünk ki és teszteltünk a 2A. ábrán bemutatott képeken. A makrót a következőképpen állítottuk be, majd elmentettük:

• Az ImageJ megnyitása és a “Plugins = > Macros = > Startup Macros”

• Keressze ki a meglévő szöveget az S1 kiegészítő táblázatban látható kódolással.

A képeket megnyitjuk az ImageJ programban, és a makrót a “Makrók = > Makró futtatása” gombra kattintva futtatjuk. Ez a képeket egyenként elemzi. A felhasználónak meg kell erősítenie, hogy a küszöbértéket helyesen állította be; csak a myofiber területet kell elemezni. A színküszöb megváltoztatható a “setThreshold(0,130)” makrósor szerkesztésével; a második szám növelésével több enyhén elszíneződött terület kerül bevonásra, míg a szám csökkentésével több terület kerül kizárásra. Ezzel a módszerrel a myofiberek területe a 6. napon elérte a 29,6%-ot (2C ábra), ami jól összehasonlítható az ugyanerre az időpontra számított fúziós indexszel (2B ábra). A Jenner- és Giemsa-festékek ugyanúgy használhatók a miotubusok fénymikroszkópos festésére, mint a LADD, azonban a LADD-vel történő festés sokszor gyorsabb, és az általunk kifejlesztett ImageJ makróval jobban ellenőrizhető, hogy mely területeket mérjük (14).

A LADD multiple stain fúziós analízisre való használatának további validálása érdekében C2C12 sejteket differenciáltunk 5 napig 10 µM BB94 (Cat. #ab142087; Abcam, Cambridge, UK) jelenlétében vagy hiányában, majd ezt követően fixáltuk és festettük LADD-vel a korábban leírtak szerint. A BB94 egy kereskedelmi forgalomban kapható szintetikus mátrix metalloproteáz inhibitor, amelyről korábban kimutatták, hogy csökkenti a mioblasztok fúzióját (15,16). BB94 jelenlétében a fúziós index szignifikánsan 50%-ról (DMSO-kontroll) 22%-ra csökkent (P < 0,05) (2D ábra); a myofiberek területének elemzése ugyanezt a tendenciát mutatta, a fúzió 46%-ról (DMSO-kontroll) 21%-ra csökkent (P < 0.05) a BB94 jelenlétében (2E. ábra).

Itt egy gyors, újszerű módszert mutatunk be mind a mioszövet szerkezetének, mind a kapcsolódó mionukleuszok festésére a LADD Multiple Stain segítségével. Ezt követően az ImageJ-t használjuk az izomrostok területének pontos értékelésére, mint a fúzió mértékére. A LADD viszonylag alacsony költsége és a feldolgozáshoz és elemzéshez szükséges jelentősen csökkentett időigénye azt jelenti, hogy a fúzió immunkémia és fluoreszcens mikroszkópia nélkül is gyorsan elemezhető egy standard laboratóriumban.

.