Catalysts of DNA Strand Cleavage at Apurinic/Apyrimidinic Sites

Compound C1 can cleave DNA containing AP site

Az első megfigyelés, amely a vizsgált kis molekulák egy részhalmazának szokatlan aktivitására utalt, akkor történt, amikor a C1-et (1a. ábra) a hOGG1 potenciális inhibitoraként tesztelték. Konkrétan, e vegyület hozzáadása a hOGG1 fluoreszcensen jelölt, helyspecifikus 8-oxo-dG adduktot tartalmazó duplex oligodeoxinukleotiddal végzett reakcióihoz (1b. ábra) egy további terméket eredményezett, amely gyorsabban vándorolt, mint a β-eliminációs termék; a hOGG1 önmagában csak a β-eliminációs terméket adta (1c. ábra). A 8-oxo-dG-tartalmú DNS-t csak C1-gyel inkubálva nem figyeltünk meg bevágott terméket.

AP-helyet tartalmazó DNS-t a megfelelő dU-tartalmú DNS UDG-vel történő kezelésével nyertünk. (a) A DNS-hasadás reprezentatív katalizátorának szerkezete. (b) DNS szubsztrátumok. (c) 8-oxo-dG-tartalmú DNS (250 nM) hasadása hOGG1 (100 nM) és C1 (10 μM) jelenlétében. (d) AP-helyet tartalmazó DNS (250 nM) hasadása hOGG1 (50 nM) és C1 (10 μM) jelenlétében. (e) AP-helyet tartalmazó DNS (250 nM) hasadása hNEIL1 (50 nM) és C1 (10 μM) jelenlétében. (f) AP-helyet tartalmazó DNS (2 μM) hasadása C1 hatására. A termékek százalékos arányát korrigáltuk a spontán hasadással. A reakciókat 37 °C-on végeztük 30 percig (b-d) vagy 16 óráig (e).

Másféle mechanikai lehetőséget feltételeztünk, amelyek az új termék képződését magyarázhatják. 1) C1 jelenlétében a hOGG1 a glikoziláz és β-eliminációs AP-liáz funkciói mellett a δ-eliminációs reakció katalizálására is képessé vált; 2) a C1 a β-eliminációs terméket δ-eliminációs termékké alakíthatja; és 3) a glikoziláz reakcióban képződött AP-helyek szubsztrátként szolgálhatnak a C1-katalizált β,δ-eliminációs reakcióhoz. E lehetőségek vizsgálatához egyetlen helyspecifikus AP-helyet tartalmazó duplex DNS-t hoztunk létre úgy, hogy a megfelelő dU-tartalmú DNS-t uracil DNS-glikozilázzal (UDG) kezeltük (1b. ábra), majd C1-gyel vagy hOGG1-gyel reagáltattuk, külön-külön vagy együttesen. A 8-oxo-dG-tartalmú oligodeoxi-nukleotidhoz hasonlóan a hOGG1 a várt β-eliminációs terméket, míg a C1 hozzáadása két termék keverékét eredményezte (1d. ábra). Ez a termékkeverék keletkezett akkor is, amikor az AP-tartalmú oligodeoxinukleotidot csak C1-gyel inkubáltuk. Míg a lassabban vándorló terméksáv helyzete megfelelt a hOGG1 β-eliminációs termékének (1d. ábra), addig a gyorsabban vándorló terméksáv együttmigrált a hNEIL1 ismert δ-eliminációs termékével (1e. ábra). A C1 tehát elősegíti a β- és δ-eliminációs reakciókat az AP-helyeken.

A C1 által az AP-helyet tartalmazó DNS-en végzett hasítási reakció koncentrációfüggő volt (1e. ábra és S1. kiegészítő ábra), a termékek megfigyeléséhez alacsony mikromoláris koncentrációk is elegendőek voltak. A korábban tervezett “mesterséges nukleázokhoz “26 hasonlóan a C1 is fordulatos katalízist mutatott a DNS-szubsztráton: 1 pmol C1 16 óra alatt ~1,4 pmol terméket hozott létre (1f. ábra). Így a C1 által végzett metszés sebessége ezen a DNS-en ~1,5 × 10-3 min-1 vagy annál nagyobb volt. A C1 összehasonlítása a jelenleg elérhető AP-liáz-reagensekkel, a sperminnel17 és a KWKK peptiddel23 azt mutatta, hogy az újonnan azonosított katalizátor legalább 100-szor hatékonyabb (Kiegészítő S1 ábra).

A C1 több szerkezeti része is fontos a katalízis szempontjából

A C1 analógjait vizsgáltuk, hogy meghatározzuk a specifikus szerkezeti jellemzők hozzájárulását a szálhasítás kémiájához. Először a C2 indolinon-pirrol-részt nélkülöző egyszerű, kereskedelmi forgalomban kapható aminok (2. ábra) és a CS1-CS3 (S2. kiegészítő ábra) képességét vizsgáltuk a DNS AP-helyen történő metszésére. A metszési termékek képződése, ha egyáltalán keletkeztek, 10 μM-nál a kimutatási szint alatt volt. Így az indolinon-pirrol rész fontos a reakcióban. Lehetséges, hogy az indolinon-pirrol alegység az AP-helyhez29 vagy a kis barázdához kötődik, és a másodlagos amin úgy helyezkedik el, hogy egy kovalens intermedier révén katalizálja a szálhasítást az AP-helyen keresztül. A C3 (2. ábra) és a CS4 vegyületek (S2. kiegészítő ábra), amelyek az indolinon-pirrol részt tartalmazzák, de hiányzik belőlük a másodlagos amin, szintén teljesen inaktívak voltak. Ezek az adatok határozottan az amin mint reaktív funkciós csoport szerepére utaltak. A pirrol metoxicsoportjának más szubsztitúciókkal való helyettesítése, például a C4-ben és a C5-ben (2. ábra), csökkent aktivitást eredményezett. A reakciót az aminocsoporton lévő szubsztituens is módosította, úgy, hogy a másodlagos amin sztérikus igényeinek növelése csökkentette a megfigyelt termék mennyiségét (vö. C1, C6 és C7 (2. ábra), valamint C4, CS5 és CS6 (S2. kiegészítő ábra)). Ezek a szerkezet-működési elemzések azt mutatták, hogy az egyes részek közül több szükséges, de nem elégséges a hasításhoz, és hogy ezeknek a részeknek kooperatívan kell működniük a szálhasadáshoz.

(a) A reprezentatív vegyületek szerkezetei. (b) DNS-szubsztrát. (c) A reprezentatív vegyületek (10 μM) AP-helyet tartalmazó DNS-t (250 nM) metsző képességének vizsgálata. A reakciókat 37 °C-on 30 in alatt végeztük.

A DNS szerkezete modulálja a C1-katalizált hasítást

Az indolinon-pirrol rész fontossága a szálhasítás kémiájában azt sugallta, hogy a DNS-szubsztrát szerkezete befolyásolhatja a C1 által közvetített hasítást. Ezen összefüggések vizsgálatához megmértük a reakció kezdeti sebességét egy egyszálú DNS (az 1a. ábrán látható szekvencia) és a megfelelő kétszálú DNS-ek esetében, amelyek az AP-ponttal szemben A-t, C-t, G-t vagy T-t tartalmaztak. A homopolimer oligodeoxi-nukleotidot, az 5′-TAMRA-(T)5-AP-(T)11-3′-t is vizsgáltuk, mint egyértelmű egyszálú DNS-szerkezetet. Ezek az adatok azt mutatták, hogy bár a szálhasadás egyszálú DNS összefüggésében is bekövetkezhet, a kettős szálú DNS-ek sokkal inkább a C1 szubsztrátjai voltak (3. ábra). Az is kiderült, hogy az AP-központtal szemben lévő bázis jellege módosította a katalízist, az AP-hely hidrolízisének sebessége gyorsabb volt a pirimidinekkel szemben, mint a purinokkal szemben. Ezek a megfigyelések összhangban vannak azzal a javaslattal, hogy az indolinon-pirrol alegység kölcsönhatásba lép a DNS-sel, hogy elfoglaljon egy üres helyet az AP-helyen. Figyelemre méltó, hogy az AP-ponttal szemben lévő C-vel rendelkező kettősszálú DNS esetében mért kezdeti sebesség nagyon közel állt az ezen szubsztrát esetében limitáló C1-koncentráció mellett megfigyelt sebességhez (1f. ábra).

A reakciókat 37 °C-on végeztük 250 nM DNS és 5 μM C1 felhasználásával. Az átlagos kezdeti sebességeket a megfelelő standard eltérésekkel együtt három független kísérletből számoltuk ki a KaleidaGraph 4.1 szoftver (Synergy Software) segítségével. A P-értékeket Students’ t-próbával számoltuk.

A DNS AP-helyeken történő C1 általi hasítása egy, a szekunder amin bevonásával létrejövő köztiterméken keresztül történik

A dezoxiribóz gyűrűsen nyitott, aldehidikus formájával történő kovalens köztitermék tesztelésére egy AP-helyet tartalmazó, 32P-jelölt oligodeoxinukleotidot (ábra. (4a.) C1-gyel inkubáltuk NaB(CN)H3 jelenlétében. Míg ez a reduktáns lassan reagál az AP-lézióval, hatékonyan csapdába ejti az imin- vagy imíniumion-konjugátumot. Az AP-helyet tartalmazó oligodeoxinukleotiddal és NaB(CN)H3-mal végzett kontrollreakcióban (4b. ábra, 5. sáv) a DNS kis hányada (~3%) mutatott csökkent mobilitást. Ez a kis abundanciájú termék gyakran megfigyelhető a csapdázási reakciókban23 , és valószínűleg Tris-molekulákkal alkotott komplexet jelent, ahogy azt korábban a malondialdehid-pirimidopurinon DNS-addiktummal30 végzett reakciókban kimutatták. A lizin-triptofán-lizin-lizin (KWKK) peptidet23 használó pozitív kontrollreakcióban az imin intermedier csapdába esett, amint azt a DNS mobilitásának eltolódása bizonyítja (4b. ábra, 3. sáv). NaB(CN)H3 és C1 jelenlétében a DNS nagy része (~80%) komplexet képzett, amely csökkent mobilitású fajként jelent meg (4b. ábra, 4. sáv). A komplexképződés nem a C1 DNS-hez való nem specifikus kötődésének volt köszönhető, mivel a megfelelő dU-tartalmú oligodeoxinukleotid azonos körülmények között történő vizsgálatakor (4b. ábra, 1. sáv) nem tapasztaltunk eltolódást. Ezek az adatok összhangban voltak azzal a hipotézissel, hogy a reagens képes volt kovalens imíniumion-intermediert képezni, amely aztán egy oldalcsoportot pozícionál a cukorgyűrűből történő proton-elvonáshoz.

(a) DNS-szubsztrátok. (b) C1 és AP-helyet tartalmazó DNS közötti komplex cianoborohidrid-csapdázása. (c) A redukált imíniumion-intermedier CID-fragmentációja. (d) A redukált C1-deoxiribóz konjugátum fragmentációja enzimatikus emésztés után.

A C1 reduktív csapdázását megismételtük nem jelölt AP-helyet tartalmazó oligodeoxinukleotiddal (4a. ábra), és a terméket tömegspektrometriával (MS) elemeztük. Az elemzés a redukált DNS-C1 kovalens komplexnek megfelelő tömeget mutatott ki (m/z 1134,64 a -2 esetében). Ennek az ionnak az ütközés indukált disszociációja (CID) a-B (bázis) és w ionok teljes halmazát eredményezte, ami összhangban van a C1 és az AP-hely közötti redukált imíniumion intermedierrel (S3. kiegészítő ábra). Az a-B ionsorozatban a C3′-O kötés fragmentációját általában a nukleobázis semleges elvesztése kíséri. A C1 és az AP-hely közötti redukált kötés várhatóan kevésbé labilis, és ennek eredményeként megfigyeltük az a4 (m/z 1330,1) iont, valamint az a4-B (m/z 1005,6) iont. Az oligodeoxinukleotidot enzimatikusan is emésztettük és MS-analízissel vizsgáltuk (4c. ábra és S4 kiegészítő ábra). Megfigyeltünk egy emésztési terméket, amelynek tömege megegyezett a redukált C1-deoxiribóz-konjugátummal (m/z 444,19); e termékion fragmentációja egy 295,09 m/z tömegű leányiont adott, amely az N-metil amino-2-deoxiribitol semleges veszteségéből származott (4d. ábra és S4. kiegészítő ábra). Ez a termék megegyezett a 2-deoxiribóz és C1 reduktív aminációs reakciójából előállított termékkel. Ezek a vizsgálatok azt mutatják, hogy a C1 az AP-helyet tartalmazó DNS-t a másodlagos amin bevonásával történő kovalens katalízis révén hasítja.

C1 növeli az AP-hely analógját tartalmazó DNS termikus stabilitását

A C1 hatását vizsgálták a tetrahidrofurán (THF), az AP-hely szerkezeti analógját tartalmazó DNS termikus stabilitására, amely nem képes a β-eliminációs reakcióra31. A T-vel ellentétes THF-et tartalmazó duplex DNS (T:THF) Tm-je 6,3 °C-kal nőtt 1 ekvivalens C1 hozzáadásával, míg a T:A párt tartalmazó kontroll DNS Tm-je kevésbé volt érintett, és csak 1 °C-kal emelkedett (5. ábra). Míg a T:THF olvadási görbéje C1-gyel a C1 általi termikus stabilizálódást jelezte, a C1 jelenléte kiszélesítette az olvadási görbét is, ami kevésbé kooperatív olvadási átmenetre utal. Ezek a megfigyelések együttesen arra utalnak, hogy a C1 specifikusan kötődik a DNS-hez az AP-helyen, lokális stabilizációt biztosítva a DNS-hélixnek. Ez összhangban van a C1 és a DNS közötti kölcsönhatások javasolt modelljével, amelyben az indolinon-pirrol rész elfoglalja az AP-helyen rendelkezésre álló helyet.

A T:A (a) és a T:THF (b) olvadási hőmérsékleti görbéket 5 μM DNS felhasználásával kaptuk 10 mM nátrium-foszfát pufferben, pH 7-ben.0, 100 mM NaCl és 1 mM EDTA nélkül (folytonos vonal) és jelenlétében (szaggatott vonal) 5 μM C1.

C1 nagyobb affinitással rendelkezik az AP-helyet tartalmazó DNS-hez

A C1 AP-helyet tartalmazó DNS-hez való kötődési módjának és affinitásának vizsgálata érdekében cirkuláris dichroizmus (CD) elemzéseket végeztünk THF-tartalmú és kontroll T:A duplex oligodeoxinukleotidokkal (6. ábra). A C1 indukált CD-je (ICD) a T:THF duplexszel való kölcsönhatáskor erős exciton jelként, a szabad C1 abszorpciós maximumához viszonyított pozitív és negatív sávokat tartalmazó biszignált alakban volt megfigyelhető. Ez általában dimer vagy magasabb rendű komplexek kialakulását jelzi, akár barázdakötési, akár külső kötési módban32. A C1 titrálása növekvő T:THF-koncentrációval (6a. ábra és S5. kiegészítő ábra) nem specifikus és specifikus kölcsönhatásokat egyaránt kimutatott. A titrálás kezdetén a C1 feleslegben van, és a nem-specifikus kölcsönhatások előnyben vannak. T:THF hozzáadásával az ICD ~488 nm-en megnőtt. Körülbelül 2 μM DNS-koncentrációnál az ICD-sáv alacsonyabb energiára (~495 nm) tolódott, majd az ekvivalenciapontig csökkent, és a DNS-túlsúlyban platójára állt, ami specifikus kölcsönhatásra utal. A C1 kontroll T:A DNS-sel történő titrálása (6a. ábra és S5. kiegészítő ábra) nem mutatta a 495 nm körüli pozitív ICD-sávot, ami a specifikus kölcsönhatás hiányára utal. A T:THF előretitrálása szintén a nem specifikus és specifikus kölcsönhatások bizonyítékát mutatta (6b. ábra). Alacsony C1-koncentrációknál a DNS többletével az ICD-sáv ~495 nm-nél volt a középpontban (specifikus); ahogy a C1 koncentrációja nőtt a DNS-hez képest, az ICD intenzitása nőtt és eltolódott magasabb energiára (~488 nm), ami nem-specifikus kötődésre utal, ahogy az magas ligandum-koncentrációknál várható. A megfigyelt hipszokróm eltolódás jelezheti a C1 megváltozott vagy határozottabb konformációját, amikor specifikusan kötődik az AP-helyhez. Az AP-hely nélküli kontroll DNS titrálása szintén ICD-t és a nem-specifikus kötődés bizonyítékát mutatta (6c. ábra). Érdemes megjegyezni, hogy a 450-520 nm-es sáv csak a C1 3-szoros feleslegénél jelent meg a DNS-hez képest, így ez a hullámhossz-tartomány volt a legjobb választás a kötési görbék megalkotásához. A kötési izotermákat a korábban közzétett egyszerű bimolekuláris kötődési modell segítségével szerkesztettük és elemeztük32. Az 500 nm-es izotermákból kapott nemlineáris egyenletek (6d. ábra) 64 μM disszociációs állandót (KD) adtak a kontroll T:A DNS-re (nem specifikus kötés) és 29 μM-ot a T:THF DNS-re (specifikus kötés); a C1 KD-jét THF-tartalmú duplexszel 22 μM-nek számítottuk a nem specifikus kötési hozzájárulás és az esetleges ligandum-ligandum kölcsönhatások korrekcióját célzó kivonás után (1. táblázat). A 495 nm-en számított KD-értékek csak kis mértékben maradtak az 500 nm-en számított értékek hibáján kívül (1. táblázat).

(a) Az 500 nm-en mért ICD-intenzitás titrálási görbéi állandó C1-koncentráció (20 μM) és növekvő DNS-koncentrációk (fordított titrálás) alkalmazásával. (b) CD-spektrumok T:THF és (c) T:A esetében állandó DNS-koncentráció (10 μM) és növekvő C1-koncentrációk alkalmazásával (előretitrálás). (d) Az 500 nm-en mért ICD-intenzitás titrálási görbéi a C1 koncentráció logaritmusának függvényében T:THF és T:A esetén (a b és c panelek adataiból származtatva). (e) Az ICD intenzitásának 500 nm-en mért titrálási görbéi a C6 koncentráció logaritmusának függvényében T:THF és T:A esetén (az S6. kiegészítő ábra adataiból származtatva). (d) Az ICD intenzitásának 500 nm-en mért titrálási görbéi a C6 koncentráció logaritmusának függvényében T:AP és T:A esetén (az S6. kiegészítő ábra adataiból származtatva).

Továbbiakban felmerült az a lehetőség, hogy a C1 affinitása más lehet a THF helyett természetes AP-helyet tartalmazó DNS esetében. Ennek a kérdésnek a megválaszolására a szerkezetileg rokon, de inaktív C6 vegyületet (2. ábra) CD-analízisekben teszteltük THF-et vagy dU-ból UDG-kezeléssel létrehozott AP-helyet tartalmazó DNS-sel. A C6 esetében a T:THF és T:A DNS-eket használó előretitrálási kísérletek során megfigyelt CD-spektrumok (S6. kiegészítő ábra) általában hasonlóak voltak a C1 esetében megfigyeltekhez (6b,c. ábra). A kötési izotermákat a fentiek szerint szerkesztettük (6e. ábra) és elemeztük. A C6 KD-jét THF-tartalmú duplexszel a nem specifikus kölcsönhatásokra korrigálva 28 μM-nak számítottuk (1. táblázat), ami csak ~25%-kal magasabb, mint a C1-re számított megfelelő KD. Így a C6 megfelelő modellnek tűnik a C1 és a DNS kölcsönhatásainak vizsgálatára. A C6 előretitrálását ezután az UDG-ból származó AP-helyet tartalmazó DNS segítségével végeztük el (S6. kiegészítő ábra). A kötési izotermák elemzései azt mutatták, hogy a C6 affinitása ehhez a DNS-hez lényegében azonos volt a THF-tartalmú DNS-hez (6f. ábra és 1. táblázat). Tekintettel arra, hogy a természetes AP-helyen a dezoxiribóz túlnyomórészt a gyűrűsen zárt, THF-szerű formában létezik31 , ez utóbbi eredmény nem volt meglepő. Várható, hogy a kovalens intermedier kialakulása előtt a C1 AP-helyet tartalmazó DNS-hez való affinitása hasonló lesz a THF-tartalmú DNS-hez mérthez. Így a C1 erősebb kötődése az AP-helyet tartalmazó DNS-hez a kontroll DNS-hez képest összhangban volt a termikus stabilitási adatokkal, és együttesen alátámasztja azt a javaslatot, hogy az indolinon-pirrol alegység egy üres helyet foglal el a DNS AP-helyén. Valószínű, hogy a C1 AP-helyhez való affinitása hozzájárul a liázaktivitásához, és egyértelmű előnyt biztosít a C2-vel, CS1-gyel, CS2-vel és CS3-mal szemben, amelyekből hiányzik az indolinon-pirrol rész (2. ábra és S2. kiegészítő ábra).

Következtetések

A jelen tanulmányban leírt AP DNS-szálhasító katalizátorok a vegyületek új osztályát képviselik, amelyek fiziológiás körülmények között felhasználhatók az AP-helyek hasítására. E magszerkezet alapján a molekulákat úgy lehet megtervezni, hogy javítsák az AP-helyek hasításának szelektivitását különböző bázisokkal szemben és potenciálisan különböző szekvencia-kontextusokra. A nagy áteresztőképességű szűrési technikák fejlesztése terén a közelmúltban elért eredményeknek köszönhetően ezek a vegyületek gyorsan továbbfejleszthetők, és hatékony reagensekké válhatnak a sejtekben és szervezetekben a depurináció vagy a BER-útvonal révén létrejövő AP-helyek hasítására. A C1 optimalizált változatainak terápiás alkalmazásai is lehetnek, különösen számos olyan gyakori rákellenes gyógyszerrel kombinálva, amelyek vagy a DNS-t károsítják, mint például az alkiláló szerek33 , vagy a DNS-javítást célozzák, mint például a PARP34,35 vagy az AP endonukleáz36 inhibitorok. Érdemes megemlíteni, hogy a β- vagy β,δ-eliminációval létrehozott 3′ végeket a DNS-polimerázok előzetes javítás nélkül nem tudják hasznosítani37. Az AP-helyek ilyen DNS-szálszakadásokká történő átalakulásának biológiai következményei várhatóan összetettek, és a sejtek különböző típusú DNS-károsodások javítására vagy tolerálására való képességétől függően változnak. A lehetséges eredmények közé tartozhat a rákellenes kezelések megnövekedett terápiás hatékonysága (hatékonyabb sejtpusztítás) és a gyógyszerek által kiváltott mutagenezis csökkenése. A DNS AP-helyeken történő hasítása különösen előnyös lehet azon rákos megbetegedések kezelésében, amelyeknél a DNS-szálszakadások javítási mechanizmusai hibásak, mint például a BRCA-hiányos rákok34,35.

.