Az Escher-FBA valós alkalmazásokban való használatának bemutatása érdekében négy kulcsfontosságú, közvetlenül a böngészőben futtatható FBA példát mutatunk be. Ezeket az FBA és alkalmazásainak áttekintéséből adaptáltuk. Ezek a példák az E. coli alapértelmezett alapmodelljére támaszkodnak, így az Escher-FBA weboldal megnyitásakor azonnal megvalósíthatóak. Ügyeljen arra, hogy minden példa között kattintson a Térkép visszaállítása gombra. Ha gondot okoz egy reakció megtalálása, egyszerűen kattintson a Nézet menü Keresés opciójára (vagy a billentyűzet “f” billentyűjével) a keresősáv megnyitásához.
FBA alternatív szénszubsztrátokkal
Az első példa az FBA használatát mutatja be annak előrejelzésére, hogy a növekedés bekövetkezhet-e alternatív szénszubsztrátokon. Az E. coli alapértelmezett központi modellje egy szimulált minimális közeget tartalmaz, amelyben D-glükóz a szénforrás. Itt a szénforrást D-glükózról szukcinátra cseréljük. Először menjen az egérrel az EX_succ_e szukcinátcsere-reakció fölé, és módosítsa az alsó határt – 10 mmol/gDW/óra értékre, vagy a csúszkát húzva, vagy az Alsó határ mezőbe beírva a – 10 értéket. Ezután menjen az egérrel a D-glükóz cserereakció EX_glc_e fölé, és vagy emelje az alsó korlátot 0-ra, vagy kattintson a Knockout gombra. Az alapértelmezett cél továbbra is a növekedés maximalizálása, így ez a két változtatás arra utasítja a programot, hogy a maximális növekedési sebességet számítsa ki, miközben D-glükóz helyett szukcinátot használ szénforrásként. Látnia kell, hogy a maximális előre jelzett növekedési sebesség 0,874 h- 1-ről 0,398 h- 1-re csökken, ami az E. coli szukcináton történő alacsonyabb növekedési hozamát tükrözi (2a. ábra). Ez az általános megközelítés a változtatások elvégzéséhez az Escher-FBA-ban; menjünk az egérrel a reakció fölé, végezzük el a kívánt változtatásokat, és az Escher-FBA automatikusan megjeleníti az eredményeket. A szénforráscserére vonatkozó alsó határértékek kísérleti méréseket képviselnek, ezért megpróbálhatja a konkrét alsó határértéket más szénforrásokon történő növekedés esetén reális értékekhez igazítani.
Példák az Escher-FBA szimulációira. (a) Szimulált növekedés szukcinát egyedüli szénforrással. (b) Szimulált anaerob növekedés glükóz minimál közegen. (c) ATP-hozam maximalizálása az alapértelmezett modellben. (d) A S. cerevisiae iMM904 modelljének növekedése. Megjegyezzük, hogy a nyilak szélességét megnöveltük a beállítások menüben, hogy a változások jobban láthatóak legyenek
FBA anaerob növekedés során
Az anaerob növekedés ugyanígy szimulálható, ha az egérrel az EX_o2_e reakció fölé mutatunk, és vagy a Knockout gombra kattintunk, vagy az alsó korlátot 0-ra módosítjuk. Ha az oxigéncserét nullára módosítja, miközben a szukcinát még mindig az egyetlen szénforrás, a Flux Through Objective (Fluxus az objektíven keresztül) kijelzőn a “Infeasible solution/Dead cell” (Megvalósíthatatlan megoldás/halott sejt) felirat jelenik meg, ami azt jelenti, hogy a növekedés nem lehetséges. Próbálja meg a jobb alsó sarokban lévő Reset gombra kattintva szimulálni egy minimális közeget D-glükózzal mint szénforrással, majd üsse ki az EX_o2_e-t, és a megjósolt növekedési sebességnek 0,211 h- 1-nek kell lennie (2b. ábra).
FBA összetett célkitűzésekkel
Escher-FBA támogatja több célkitűzés beállítását az összetett célkitűzések módban. Az alapértelmezett modellben egy új célkitűzés beállítása mindig letiltja az előző célkitűzést. Az üzemmód engedélyezéséhez először kattintson a képernyő alján található Compound Objectives gombra. Egy példa az üzemmód használatára: a maximális növekedési sebesség ellenőrzéséhez a SUCDi-n keresztüli fluxus minimalizálása mellett kezdje a biomassza-termelés maximalizálásának alapértelmezett célkitűzésével. Ezután menjen az egérrel a SUCDi reakciócímke fölé, és kattintson az eszköztáron belül a Minimalizálás gombra. A jobb alsó sarokban mindkét célt fel kell tüntetnie. Vegye figyelembe, hogy jelenleg csak az 1 vagy – 1 objektív együtthatók (amelyeket a Maximize és a Minimize jelképez) támogatottak. Az egyes célkitűzésekhez való visszatéréshez kattintson újra az Összetett célkitűzések gombra.
A metabolikus hozamok elemzése
Az Escher-FBA-t használhatjuk a prekurzorok és kofaktorok, például az ATP maximális hozamának meghatározására is. Mindössze egy sztöchiometrikusan kiegyensúlyozott reakcióra van szükség, amely elfogyasztja az adott kofaktort. Az ATP-karbantartási (ATPM) reakció egy ilyen példa. Az ATP maximális termelésének meghatározásához egyszerűen menjen az egérrel az ATPM-reakció fölé, és kattintson a Maximize gombra. A célkitűzés ilyen módon történő beállítása azért működik, mert ahhoz, hogy a rendszer maximalizálja a fluxust az ATPM-reakción keresztül, először a lehető legnagyobb mennyiségben kell ATP-t termelnie. Ha az ATPM-et maximalizáljuk az E. coli alapértelmezett alapanyagcsere-modelljében, a célérték 175 mmol/gDW/óra. (2c. ábra). Szukcinát szénforrással ez az érték 82,5 mmol/gDW/h-ra csökken. Ugyanezt az eljárást követhetjük bármely érdekelt metabolit esetében egy sztöchiometrikusan kiegyensúlyozott fogyasztási reakció létrehozásával és a modell beállításával, hogy maximalizálja az ezen a reakción keresztüli fluxust. Megjegyzendő, hogy jelenleg nem lehetséges egy ilyen reakció automatikus létrehozása az Escher-FBA-ban, de ez egy jövőbeli kiadáshoz hozzáadható.
Fluxusvariabilitás elemzése
A metabolizmus alternatív optimális megoldásainak elemzése az FBA másik hasznos alkalmazása. Mivel az FBA által előállított megoldások gyakran nem egyediek, hasznos lehet ismerni a fluxusértékek tartományát, amelyet egy adott reakció elérhet. A fluxusvariabilitás-elemzést (FVA) gyakran használják e tartományok kiszámítására a teljes hálózaton. Az Escher-FBA nem támogatja közvetlenül az FVA-számításokat, de egy adott reakcióra vonatkozóan ki lehet számítani őket. Ehhez először menjen az egérrel a célfüggvény (a Biomass_Ecoli_core_w_GAM biomassza reakció) fölé, és állítsa a felső és alsó határokat az aktuális fluxusértéknél valamivel kisebbre (az alapértelmezett térképen próbálja ki a 0,870-et). Ezután menjen az egérrel egy érdekes reakció fölé, és kattintson a Maximize és Minimize gombokra, hogy megnézze az optimális növekedési ráta mellett az adott reakción áthaladó maximális és minimális fluxust. Például a GAPD-n keresztüli fluxus maximalizálása és minimalizálása a glikolízisben 15,44-16,68 mmol/gDW/óra közötti megvalósítható fluxustartományt eredményez, ami azt jelzi, hogy a glikolitikus fluxus nagy növekedési sebességnél erősen korlátozott. Másrészt a MALS-on keresztüli fluxus maximalizálása és minimalizálása a glioxilát söntben 0-2,64 mmol/gDW/óra megvalósítható fluxustartományt eredményez, ami azt jelzi, hogy a glioxilát sönt aktiválódhat vagy inaktív lehet nagy növekedési sebességnél. Ez az eljárás bármely reakciókészlettel elvégezhető, és a felhasználó tetszőleges számú fluxusértékre korlátozhatja a rendszerét, hogy lássa az adott reakcióhoz rendelkezésre álló megoldások tartományát.
Más genomszintű modellek használata
Az alapértelmezett E. coli magmodell nem az egyetlen szimulálható rendszer. Ha például élesztősejteken szeretnénk szimulációkat futtatni, a Saccharomyces cerevisiae modellje és térképe letölthető a http://bigg.ucsd.edu/models/iMM904 címről. Ezen az oldalon kattintson a modell (iMM904.json) és a térkép (iMM904.Central carbon metabolism.json) letöltése gombra. Töltse be ezeket az Escher-FBA-ban a Map menü Load Map JSON és a Model menü Load Model JSON gombjára kattintva, hogy mindkét JSON fájlt betöltse. A betöltés után a térkép készen áll a szerkesztésre és szimulációra az Escher vagy az Escher-FBA bármelyik eszközével (2d. ábra). Egy nagyobb modellnél, mint az iMM904, nem minden reakció lesz látható egyszerre, de hozzáadhat egy reakciót a vizualizációhoz. Először vagy kattintson az oldalsávban lévő csavarkulcs ikonra, vagy válassza a Szerkesztés menüből a Reakciómód hozzáadása parancsot. Most a reakciókat úgy lehet hozzáadni, hogy a térképen bárhová kattintunk, és a legördülő menüből kiválasztjuk a kívánt reakciót. A szövegbeviteli mezőben lehet keresni az adott reakciót.
Az Escher-FBA alkalmazása mikrobiális sejtgyárak tervezéséhez
Az Escher-FBA segítségével tesztelhető kutatási hipotézis példájaként betöltöttük az E. coli genomszintű modelljeit, amelyek két útvonalat tartalmaznak az 1-propanol előállítására a vegyipari termeléshez. Ezeket az útvonalakat nemrégiben elemeztük egy tanulmányban, amely a genomléptékű modellek előrejelző erejéről szólt a valós mikrobiális sejtgyári törzsek szimulálásához . Az első modell az 1-propanol előállításának egyetlen útvonalát tartalmazza (Additional file 1), amelyről először Atsumi és társai számoltak be. A második modell két szinergikus útvonalat tartalmaz az 1-propanol termeléséhez (Additional file 2), amelyről először Shen és Liao számolt be . Mindkét modell külön-külön is betölthető (a Modell > Load COBRA model JSON menügombbal), és a központi anyagcsere egyetlen térképét adjuk meg, amely mindkét modellel kompatibilis (Additional file 3, betölthető a Térkép > Load Map JSON menügombbal).
Kíváncsiak voltunk, hogy az 1-propanol termelésének szinergista megközelítése – amelyről ismert, hogy nagyobb termelési hozammal jár – a szükséges útvonalak használatában is van-e különbség. Ezért minden modellt külön-külön betöltöttünk, maximalizáltuk az 1-propanol kiválasztását (az EX_1poh_e fölé vittük a lebegőgombot és a Maximize gombra kattintottunk), a maximális érték 99%-ában állítottuk be a kiválasztás alsó határát, majd minimalizáltuk a pentóz-foszfát útvonal első elkötelezett lépésén, a glükóz-6-foszfát-dehidrogenázon (G6PDH2r) áthaladó fluxust. Az így kapott térképek azt mutatják, hogy az 1-propanol-termelés szinergikus útjai sztöchiometrikusan egyensúlyban vannak a glikolízissel, így nem igényelnek PPP-aktivitást (3b. ábra). Ezzel szemben az egyéni útvonal jelentős PPP-fluxust igényel (3a. ábra). Az egyéb útvonalhasználat, például az egyes esetekhez szükséges TCA-fluxus is feltárható ezeken a térképeken.
Az 1-propanol-termelés két heterológ útvonalának útvonalhasználata E. coli-ban. Az egyes heterológ termelési utakhoz szükséges pentóz-foszfát útvonal (PPP) fluxusát úgy lehet összehasonlítani, hogy egyrészt az 1-propanol termelését a maximális érték 99%-ára kényszerítjük (az 1-propanol cserereakció alsó határának beállításával), másrészt minimalizáljuk a PPP első lépésén keresztül történő fluxust. (a) Az Atsumi és munkatársai által közölt 1-propanol-útvonal egyetlen útvonalat használ az 1-propanol-termelés eléréséhez. Jelentős PPP-fluxust igényel, és alacsonyabb az összhozama. (b) A Shen és Liao által közölt útvonal két útvonalat használ szinergikusan a nagyobb hozam elérése érdekében. Az útvonal sztöchiometrikusan egyensúlyban van a glikolízissel, így nem igényel PPP fluxust
Míg az Escher-FBA már számos FBA-szimulációhoz közvetlenül a webböngészőben használható, az Orth et al. által bemutatott példák egy része jelenleg nem valósítható meg az Escher-FBA-val. Jelenleg az Escher-FBA nem képes olyan funkciókat végrehajtani, mint a génkiütéses elemzés vagy a robusztussági elemzés. Az Escher-FBA azonban rugalmas SVG-reprezentációkat használ a vizuális elemekhez, így a robusztussági elemzés és még olyan grafikus funkciók is hozzáadhatók, mint a fázissíkok. Létrehoztunk egy fejlesztési ütemtervet az Escher-FBA számára (elérhető a honlapon https://sbrg.github.io/escher-fba) és egy iteratív fejlesztési folyamatot, hogy végül lehetővé tegyük a komplex rendszerbiológiai elemzést a webböngészőben.