Vizsgálati populáció
Ez a vizsgálat a lengyelországi, csehországi és litvániai HAPIEE kohorszokon (Health, Alcohol and Psychosocial factors in Eastern Europe) , valamint a német ESTHER kohorsz (német neve: “Epidemiologische Studie zu Chancen der Verhütung, Früherkennung und optimierten Therapie chronischer Erkrankungen in der älteren Bevölkerung”) 8 éves követésén alapul.
A teljes HAPIEE tanulmány négy ország kohorszait foglalja magában. Mivel Oroszországból nem lehetett vérmintákat exportálni, a jelenlegi elemzésbe csak három kohorsz került bevonásra. A vizsgálat résztvevőit hat cseh városban (Havirov/Karvina, Hradec Kralove, Jihlava, Kromeriz, Liberec és Usti nad Labem) 2002-2005 között (n = 8 857), a lengyelországi Krakkóban 2002-2005 között (n = 10 728) és a litvániai Kaunasban 2006-2008 között (n = 7 161) toborozták. Mindegyik kohorsz a kiinduláskor 45-75 éves férfiak és nők véletlenszerű mintájából áll, nem és 5 éves korcsoportok szerint rétegezve, a népesség-nyilvántartásokból kiválasztva. Az általános válaszadási arány 61% volt. Az adatokat kérdőívvel és egy rövid klinikai vizsgálattal gyűjtötték, amelynek során éhgyomri vénás vérmintát vettek.
Az ESTHER vizsgálat egy 9 949, a kiinduláskor 50-74 éves felnőttből álló, lakossági kohorsz, amelyet háziorvosuk (GP) toborzott 2000 és 2002 között a Saar-vidék német szövetségi államban egy rutin egészségügyi vizsgálat során. A jelenlegi vizsgálat a 2008 júliusa és 2010 decembere között végzett 8 éves utánkövetésen alapul, amelynek során a vizsgálatban résztvevők 56 és 85 év közöttiek voltak. A vizsgálat kezdetétől a 8 éves nyomon követésig 499 személy elhunyt, 505 személy rossz egészségi állapot miatt már nem tudott részt venni a vizsgálatban, 680 személy pedig visszautasította a további részvételt. A fennmaradó 8265 résztvevő közül 6061 küldte vissza a kérdőívet (válaszadási arány 73,4%), 4637 pedig vérmintát adott háziorvosa rendelőjében. A vizsgálatban résztvevők háziorvosai szintén kitöltöttek egy kérdőívet a vizsgálatban résztvevők egészségi állapotáról (n = 5 997 esetében állt rendelkezésre). Továbbá 3124 vizsgálati résztvevő hozzájárult egy további 3 órás geriátriai felméréshez, amelyet a vizsgálati orvosok a résztvevők otthonában végeztek el.
Az ESTHER és a HAPIEE vizsgálatok változóit harmonizálták, és az oxidatív stressz markereit az Egészség és öregedés konzorcium keretében mérték: Network of Cohorts in Europe and the United States (CHANCES; www.chancesfp7.eu) keretében, amelyről máshol már beszámoltunk . A vizsgálatokat a Helsinki Nyilatkozatnak megfelelően végezték, és minden vizsgálati résztvevőtől írásbeli, tájékozott beleegyezést szereztek be.
Etika, beleegyezés és engedélyek
A bevont tanulmányokat a megfelelő helyi etikai bizottságok (ESTHER: a Heidelbergi Egyetem orvosi kara és a Saar-vidéki Orvosi Kamara; HAPIEE: University College London (Nagy-Britannia), Nemzeti Közegészségügyi Intézet (Prága, Cseh Köztársaság), Jagelló Egyetem (Krakkó, Lengyelország) és Litván Egészségtudományi Egyetem (Kaunas, Litvánia)) hagyták jóvá. Az elemzett vizsgálatokba bevont valamennyi résztvevőtől írásbeli, tájékozott beleegyezést kaptak, és a vizsgálatokat a Helsinki Nyilatkozatnak megfelelően végezték.
Kovariánsok értékelése
Az ESTHER és a HAPIEE vizsgálatokban a szociodemográfiai, életmódbeli és kórtörténeti adatokat önkitöltős kérdőívekkel értékelték. Az ESTHER-ben megmérték a testmagasságot és a testsúlyt, és önbevallással egészítették ki azokat a vizsgálati résztvevőket, akik nem járultak hozzá a házi látogatáshoz. Az önbevalláson túlmenően a gyakori krónikus betegségek kórtörténetét az ESTHER-vizsgálatban az orvosi feljegyzések vagy a Saar-vidéki rákregiszter lekérdezésével validálták. A veseelégtelenséget a kreatinin alapú Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration egyenlet alapján számított <60 ml/perc/1,73 m2 becsült glomeruláris szűrési sebességgel határozták meg. Az ESTHER kohorszban a szérum kreatinin koncentrációját kinetikus Jaffé-módszerrel határozták meg Cobas 8000 C701 készülékkel (analit: CREJ2 3000, Roche). Az összkoleszterint és a nagy sűrűségű lipoprotein-koleszterint (HDL) a szérummintákban enzimatikus kromatográfiával (analit: Chol2 2100, HDLC3 450, Roche), a C-reaktív fehérjét (CRP) pedig immunturbidimetriával határozták meg a Cobas 8000 C701 készülékkel (analit: CRPL3 500, Roche). A HAPIEE-ben az össz- és HDL-koleszterint is ugyanezzel a vizsgálati módszerrel és Roche analitekkel vizsgálták, de különböző autoanalizátorokat használtak (HAPIEE Csehország és Litvánia: Roche Cobas Mira; HAPIEE Lengyelország: Hitachi 917/Modular P). Ezenkívül valamennyi HAPIEE-kohorszban a szérumkreatinint és a CRP-t ugyanazzal a vizsgálati módszertannal határozták meg, mint az ESTHER-ben, de más szállítótól (Beckman-Coulter) származó analitekkel és más autoanalizátorral (LX-20 Pro, Beckman-Coulter).
Mortalitás megállapítása
Az elemzésekhez az országos (Cseh Köztársaság, Németország), helyi (Litvánia) vagy regionális (Lengyelország) hivatalos halálozási nyilvántartások (Lengyelország) által 2010. december 31-ig Lengyelországban, 2011. december 31-ig Csehországban és Litvániában, valamint 2014. július 31-ig Németországban a teljes halálozás nyomon követését használtuk. Németországban csak a 2013. április 2-ig bekövetkezett halálesetekre vonatkozóan állt rendelkezésre ok-specifikus halálozási adat. A nyilvántartások minden olyan résztvevő esetében teljesek voltak, akik nem költöztek ki a nyilvántartás által lefedett régióból. Az elvándorlás miatti követési veszteség 4 % volt a HAPIEE kohorszokban (együttesen) és 2 % az ESTHER vizsgálatban. Minden, az I00-I99 ICD-10 kóddal kódolt halálesetet kardiovaszkuláris halálesetnek tekintettek, a rákos haláleseteket pedig a C00-C97 ICD-10 kódokkal határozták meg.
Oxidatív stressz szérum markerek mérése
A d-ROMs szintek (Diacron, Grosseto, Olaszország) és a TTL (Rel Assay Diagnostics, Gaziantep, Törökország) mérésére használt analíziseket az Egészségvédelmi Kutató Laboratóriumban (Bilthoven, Hollandia) egy autoanalizátorhoz (LX20-Pro, Beckman-Coulter, Woerden, Hollandia) igazították a korábban leírtak szerint . A d-ROMs-teszt a hidroperoxid-koncentrációt Carratelli-egységben (Carr U) méri, amelyet a teszt feltalálójáról, Mauro Carratelliről neveztek el. Minden Carr U 0,08 mg hidrogén-peroxidnak (H2O2)/100 ml mintának felel meg. A TTL-teszt a szabad tiolcsoportok koncentrációját méri a mintában μmol/l-ben.
A méréseket olyan szérummintákban végeztük, amelyeket körülbelül 3-10 évig -80 °C-os fagyasztóban tároltak. d-ROM és TTL ilyen körülmények között jó hosszú távú stabilitással rendelkezik . Az ESTHER 8 éves utánkövetés során a d-ROM-okat és a TTL-t minden olyan résztvevőnél megmérték, aki vérmintát adott a háziorvosi rendelőben (n = 4637). A méréseket azonban két különböző időpontban végezték el, mivel a 2012 júniusában végzett kísérleti vizsgálatban nem állt rendelkezésre az összes minta méréséhez szükséges finanszírozás . A vizsgálatok esetleges elmozdulásainak korrigálása érdekében az 1. időpontban (2012 júniusában) vett 80 mintát a 2. időpontban (2014 szeptemberében) újra megmértük, és lineáris regressziós egyenleteket kaptunk, amelyeket a 2. időpontban kapott eredményeknek az 1. időpontban mért szintekre történő standardizálására használtunk, amikor a HAPIEE-kohorszokban is megtörténtek a mérések (a 2012-es év folyamán). A d-ROM mérések egyezése magas volt (Spearman korrelációs együttható r = 0,92 és az átlagok különbsége = 15 Carr U), ezért nem alkalmaztunk korrekciókat. A TTL esetében a vizsgálati eredmények nyilvánvaló eltolódását (r = 0,88 és az átlagok különbsége = 81 μmol/l) úgy korrigáltuk, hogy a következő egyenletet alkalmaztuk a 2. időpont összes mérésére: TTLidőpont2 = 0,746 × TTLidőpont1. Továbbá 610 olyan vérmintában végzett mérést zártunk ki, amelyek nem feleltek meg az ESTHER-vizsgálat szigorú hemolitikus, ikterikus és lipémiás minőségi kritériumainak, így a jelen vizsgálatban 4 027 mérés maradt elemzésre. A HAPIEE kohorszokban elhanyagolható volt azon minták száma, amelyek nem feleltek meg ezeknek a minőségi kritériumoknak.
Analitikai vizsgálati minta
A korlátozott finanszírozás miatt a HAPIEE kohorszokban nem mértük a d-ROM-szinteket és a TTL-t minden résztvevőnél; ehelyett illesztett esetkontroll-designt alkalmaztunk (Additional file 1: S1 ábra). Az eseteket úgy határozták meg, mint minden olyan alany, aki a követés során meghalt (n = 1433), vagy akinél nem halálos szívinfarktus (MI) vagy stroke fordult elő (n = 658). A kontrollok (n = 4396) nem és 5 éves korcsoportok szerint megfeleltek az eseteknek. A halálozási elemzésben az MI és a stroke túlmintavételezésének korrigálása érdekében a követés során nem halálos kimenetelű MI-t vagy nem halálos kimenetelű stroke-ot elszenvedő személyeket első lépésben kizárták az esetek közül. Annak érdekében, hogy a nem halálos kimenetelű MI- vagy stroke-eseményekkel érintett személyek reprezentatív mintáját hozzáadjuk a kontrollokhoz, egy második lépésben kiszámítottuk a nem halálos kimenetelű MI- vagy stroke-események megfigyelt arányát az egyes kor- és nemspecifikus rétegekben a teljes kohorszon belül. Egy harmadik lépésben ezeket az arányokat megszorozták az egyes rétegekben a mért oxidatív stresszmarkerekkel rendelkező kontrollok mintanagyságával. Egy negyedik lépésben az így kapott számokat minden rétegben véletlenszerűen választották ki a nem halálos kimenetelű MI vagy stroke eseményt szenvedett alanyok csoportjából, és hozzáadták a kontrollokhoz, így az 1433 halálesethez 4552 alkalmas kontrollt kaptunk. Az utolsó lépésben az alkalmas kontrollok poolját arra használták, hogy minden egyes halálesethez egyenként pontosan két kontrollt rendeljenek kohorsz, nem és életkor (±5 év) szerint.
Statisztikai elemzések
Az esetek (követés közbeni halálozás) és a kontrollok közötti kiindulási jellemzők közötti különbségeket kategorikus változók esetében a χ2 teszttel, folyamatos változók esetében pedig a Wilcoxon rank-sum teszttel értékelték. A halálozás megállapított kockázati tényezőinek és a magas oxidatív stressz-szinteknek a keresztmetszeti összefüggéseit logisztikus regressziós modellekkel értékelték, amelyekben az összes kiindulási jellemzőt kategorikus változóként modellezték (1. táblázat). A “magas oxidatív stressz” függő változót a d-ROM-szintek vagy a TTL alapján két különböző definícióval határozták meg. A d-ROM-ok esetében a gyártó utasításainak megfelelően >400 Carr U klinikai határértéket alkalmaztunk, amely az ESTHER-kohorsz 23%-át és a HAPIEE-kohorsz megfelelő kontrollcsoportjainak 30%-át sorolta a “magas” oxidatív stressz kategóriába. A TTL esetében nem állnak rendelkezésre klinikai határértékek, és mivel a vizsgálat még nem szabványosított, a populációs átlagok a kohorszok között erősen eltérőek voltak. Ezért a d-ROM-szinteken alapuló meghatározás alapján kapott magas oxidatív stresszben szenvedő egyének arányának megfeleltetése érdekében az alsó kohorszspecifikus TTL-kvartilt (25 %) használtuk a vizsgálati alanyok TTL alapján történő magas oxidatív stressz-kategóriába sorolásához. A keresztmetszeti elemzéseket az összes alanyon, valamint külön-külön a nőkön és a férfiakon végeztük el.
A longitudinális elemzésekhez, Cox-proporcionális hazard regressziót (ESTHER kohorsz) és feltételes logisztikus regressziót (HAPIEE illesztett eset-kontroll vizsgálat) használtunk a kockázati arányok és esélyhányadosok becslésére a d-ROM-szintek növekedésére, illetve a TTL egy kohorsz-specifikus standard eltéréssel (SD) történő csökkenésére. Ezenkívül a d-ROMs-szinteket kategorikus változóként is modelleztük, a gyártó által ajánlott klinikai határértékekkel a mérsékelt (341-400 Carr U), magas (401-500 Carr U) és nagyon magas oxidatív stressz (>500 Carr U) esetében, a nem emelkedett vagy alacsony oxidatív stresszel (≤340 Carr U) rendelkező alanyokhoz viszonyítva. Ha az abszolút kockázat alacsony, a logisztikus és a Cox-regresszió általában hasonló eredményeket ad, és az esélyhányados a pontosabb hazard ratio közelítésének tekinthető. Mindkét hatásbecslés esetében a relatív kockázat (RR) kifejezést használtuk. Az érzékenységi elemzés során az ESTHER-kohorszban az ok-specifikus halálozásra vonatkozó elemzéseket az egyéb okok miatti halálozás versengő kockázatának figyelembevételével végeztük el, a Fine és Gray-módszer kiterjesztése szerint a versengő kockázatú eseményen átesett alanyok számára súlyokkal ellátott arányos szubdisztribúciós hazard regressziós modell illesztésével . Az eredmények azonban szinte azonosak voltak a hagyományos Cox-féle arányos hazard regresszióval, ezért ebben a kéziratban csak az utóbbi eredményeket mutatjuk be.
Az elemzéseket minden kohorszra külön-külön végeztük el, majd Mantel-Haenszel súlyozással és véletlenszerű hatásokkal végzett metaanalízissel összevontuk, figyelembe véve a kohorszok mintanagyságát és a vizsgálatok közötti statisztikai heterogenitás lehetőségét. Ez utóbbit a Cochrane-féle Q-teszttel és az I2-statisztikával vizsgálták.
A következő kimeneteleket elemezték: halálozás minden okból, CVD, rák és nem-CVD, nem rákos okokból. Minden kimenetelre négy statisztikai modellt dolgoztak ki, a megállapított halálozási kockázati tényezők növekvő mértékű bevonásával a modellekbe. A d-ROM-szinteket és a TTL-t mindig ugyanabba a modellbe vonták be, mivel korrelációjuk alacsony volt (r <0,08 minden kohorszban). Az 1. modellben az ESTHER-kohorszban kiigazítást végeztek az életkor és a nem szerint, míg a HAPIEE-kohorszok esetében erre nem volt szükség, mivel az eseteket kor és nem szerint egyenként két kontrollhoz párosították, és rétegzett elemzésben elemezték, amelyben a rétegek a párosított halmazok gyűjteményéből állnak. A 2. modellben ezen felül kiigazították az iskolai végzettséget, a testtömegindexet (BMI), a dohányzást, az alkoholfogyasztást és a fizikai aktivitást. A 3. modellbe olyan betegségeket is bevontak, amelyek potenciálisan közvetíthetik az oxidatív stressz és a halálozás közötti összefüggést (azaz dyslipidaemia (az össz- és HDL-koleszterinszint alapján értékelve), veseelégtelenség, cukorbetegség, magas vérnyomás, MI, stroke és rák). Végül a 4. modellben a CRP-szinteket is korrigáltuk, amelyek erősen korreláltak a d-ROM-szintekkel (r = 0,34-0,41 a kohorszokban) és kevésbé erősen a TTL-szintekkel (r = 0,11-0,17 a kohorszokban). Az életkort folytonos változóként, az összes többi változót pedig kategorikus változóként modelleztük (a kategóriákat az 1. táblázat tartalmazza). A d-ROMs/TTL és a kovariánsok közötti kölcsönhatásokat úgy vizsgáltuk, hogy a 2. modellhez megfelelő interakciós feltételeket adtunk hozzá.
Az elemzendő alcsoportokat a priori választottuk ki azzal a céllal, hogy a magas oxidatív stresszszintek legfontosabb potenciális meghatározó tényezői szerint rétegezzük: kohorsz/ország, életkor, nem, nem, MI vagy rákos megbetegedés anamnézise és gyulladásos állapot. A minta méretének korlátozása miatt a rétegzett elemzéseket az összes okból bekövetkező halálozásra, a CVD-re és a rákra korlátozták. A fordított ok-okozati torzítás lehetőségének kiküszöbölése érdekében az elemzéseket külön-külön végeztük el az 1-2., a 3-4. és az 5-6. követési évben bekövetkezett eseményekre. A mintanagyság korlátozása miatt ezt a rétegzett elemzést csak a teljes halálozásra vonatkozóan lehetett elvégezni. A modell instabilitásának elkerülése érdekében a kohorszspecifikus alcsoport-elemzés eredményét csak akkor vettük figyelembe a metaanalízishez, ha az alcsoportban legalább 25 esemény történt.
A kiegészítő fájl 1: S1 táblázatban szereplő hiányzó kiindulási kovariánsértékek számának imputálásához többszörös imputációt alkalmaztunk. A hiányzó értékek aránya minden változó esetében 5 % alatt volt, kivéve az alkoholfogyasztás és a fizikai aktivitás esetében, ahol a hiányzó értékek aránya elérte a 22 %-ot. Legjobb tudomásunk szerint az adatok véletlenszerűen hiányoztak, ami a többszörös imputálás feltételezése. Kohorszonként, esetstátuszonként és nemenként külön-külön 20 teljes adatkészletet imputáltunk a SAS 9.3 “PROC MI” eljárásával, a Markov-lánc Monte Carlo módszerrel. Az imputációs modellhez a “teljes” modell változókat használták. Minden többváltozós elemzést a 20 imputált adatkészleten végeztünk, és az egyes adatkészletek eredményeit a SAS 9.3 “PROC MIANALYZE” eljárásával kombináltuk.
A metaanalíziseket a Comprehensive Meta-Analysis 2.0 statisztikai szoftverrel (Biostat, Englewood, NJ, USA) végeztük. Minden más elemzést a SAS 9.2-es verziójával (Cary, Észak-Karolina, USA) végeztünk. Minden statisztikai teszt kétoldalas volt, 0,05-ös alfa-szintet alkalmazva.