Frontiers in Materials

Extracelluláris mátrix

Az extracelluláris mátrix (ECM) fehérjék és a sejtek közötti kölcsönhatások fontos szerepet játszanak a citoszkeletális szervezetben, a sejtnövekedésben, a sejtvándorlásban és a szövetek fejlődésében (Zhong et al., 1998; Sternlicht és Werb, 2001; Stevens és George, 2005). Az ECM szekretált molekulákat tartalmaz, amelyek a sejtek mikrokörnyezetét alkotják. Az ECM fő alkotóelemei glikozaminoglikánok (GAG-ok) és rostos fehérjék, köztük elasztin, kollagének, laminin és fibronectin hidrofil, kiterjedt gélek hálózata, amelyek inter- és intramolekulárisan specifikus kötődoméneken keresztül kapcsolódnak egymáshoz. A GAG-ok, mint például a heparán-szulfát, a kondroitin-szulfát és a keratán-szulfát erősen duzzadt szénhidrátpolimerek, amelyek az ECM fehérjékhez kapcsolódva proteoglikánokat alkotnak. A GAG-ok ozmózis útján képesek vizet tartani, hogy a növekedési faktorokat, az ECM-et és a sejteket hidratáltan és aktívan tartsák. A GAG-molekulák biológiai tevékenységek széles skáláját szabályozhatják, beleértve az angiogenezist, a fejlődési folyamatokat, a tumor metasztázisát és a véralvadást (Kim és mtsai., 2011). Például a kollagének, az ECM legnagyobb mennyiségben előforduló fehérjéi, a csontmátrix fehérjetartalmának 90%-át teszik ki. A kollagének fibrilláris fehérjék formájában vannak jelen az ECM-ben, és strukturális állványzatot biztosítanak a sejtek befogadásához. Szerkezetileg a kollagén a prokollagénből áll össze, amely három balkezes hélixből áll. A rostos prokollagén úgy rendeződik, hogy egy nagyjából 1,5 nm átmérőjű és 300 nm hosszú, elnyújtott szuperhélix szerkezetet alkot. A prokollagének in vivo és in vitro spontán önszerveződéssel képesek akár több mikron hosszúságú, 10 és 500 nm közötti szélességű, 67 nm-es periodicitású fibrillákká összeállni. A kollagének aggregációs állapota és térbeli eloszlása modulálja a sejtek fejlődését és az integrinek felismerésén keresztül történő jelátvitelt (Hui et al., 2008; Huang et al., 2010a).

A fibronektinek olyan glikoproteinek, amelyek a sejteket az ECM-ben lévő kollagénvázakhoz kötik, lehetővé téve a sejtek vándorlását az ECM-ben. Ezért az ECM-hálózat alapszerkezetének megszervezésében és a sejtek viselkedésének szabályozásában a fibronectinek kollagénekhez való kapcsolódása különösen fontos (roekelmann és mtsai., 1991; Dalton és mtsai., 1995). Gyógyuló sebekben például a fibroblasztok nagy mennyiségben expresszálják a simaizomaktint, a prokollagént és a fibronektint. Kimutatták, hogy a fibronektin a sejtek kollagénhez való rögzülésének közvetítője. Így a sejtek ECM-hez való tapadása fontos a későbbi differenciálódási és proliferációs viselkedés szempontjából (Ingber, 2003). In vitro környezetben a sejteket a tenyésztési felületekre ültetik, és hamarosan képesek alkalmazkodni a környezetükhöz azáltal, hogy megfelelő ECM-fehérjéket, például fibronectint választanak ki, hogy átalakítsák a felületeket a jobb terjedés és tapadás érdekében. Az ECM intermolekuláris kölcsönhatásai dinamikusan változnak a sejtek aktivitásával. Az összetett folyamat a tenyésztési környezettel függ össze, beleértve a táptalajt, az adszorbeált fehérjéket, az alapul szolgáló szubsztrátumot és a sejttípusokat. Megállapították, hogy a sejtek adhéziójához és terjedéséhez kollagénnel bevont felületeken elegendő mennyiségű fibronektin szükséges (Grinnell és Minter, 1978; Dewez és mtsai., 1999). Ezenkívül az alapul szolgáló szubsztrátumok felületi tulajdonságai dominálnak a fehérjék adhéziójában, ami a lerakódott fehérjék különböző felületi tartalmához, konformációjához és koncentrációjához vezet. Meg kell jegyezni, hogy a hagyományos tenyésztési rendszerek, mint például az üveg, és a nem specifikus fehérjeadszorpciót elősegítő szövettenyésztési polisztirol, nem képesek határozottan vizsgálni a sejtek és az ECM-ben lévő megfelelő komponens/fehérje közötti kölcsönhatásokat.

A legtöbb emlőssejt csak akkor képes in vitro növekedni, ha az ECM-fehérjék lerakódásával rendelkező felületekhez kapcsolódnak. Az ECM többet nyújt, mint strukturális és mechanikai támogatást, az őssejt niche-ekben, a fejlődési mintázat kialakításában és a rákos megbetegedések előrehaladásában jelentkező implikációkat. Az ECM fizikai tulajdonságai kritikus pozíciót tölthetnek be a jelátviteli folyamatban is. Az ECM struktúrák nyújthatók és rugalmasak lehetnek, és a különböző mechanikai feszültségek kriptikus helyekre kényszeríthetnek, amelyek tovább reagálhatnak receptoraikkal vagy növekedési faktorokkal. Ami a mechanikai tulajdonságokat illeti, az ECM különböző mértékű rugalmassággal, és merevséggel rendelkezhet, a kemény csontszövetektől a lágy agyig, aszerint, hogy milyen összetételűek, koncentrációjúak és keresztkötési szerkezetűek. Az ECM rugalmassága több nagyságrendet is átfoghat, ami bizonyítottan fontos szerepet játszik számos sejtfunkció, például a sejtek összehúzódásának, sejtproliferációjának, migrációjának, differenciálódásának és sejthalálának szabályozásában (Discher et al., 2005; Engler et al., 2006). Emellett megállapították, hogy az ECM fehérjék nanostruktúrái jelentősen befolyásolhatják a sejtek aktivitását (Koyama et al., 1996; Jones et al., 1997; Huang et al., 2010a). Az I-es típusú kollagén a természetben spontán spirálszerkezetet képez. Hő- és savkezelés után a kollagén szabályos háromdimenziós szerkezete megsemmisül (denaturált kollagén vagy zselatin). Meglepő módon a denaturált kollagén elősegíti a simaizomsejtek (SMC) sejtek jobb terjedését és proliferációját a vad típusú kollagénhez (natív kollagén) képest. Egy mechanisztikus vizsgálat azt javasolta, hogy a natív kollagén elnyomja a ciklinfüggő kináz 2 (Cdk2) és a ciklin E-asszociált kináz foszforilációját, miközben növeli a Cdk2 inhibitorok p21Cip1/waf1, és p27Kip1 szintjét (Koyama és mtsai., 1996). Úgy tűnt, hogy ez a hatás kontrollálja a pulmonális őssejtek növekedését az elsődleges tenyésztési rendszerben (Huang és mtsai., 2010a). A rendszer stroma sejteket, tüdő őssejteket és I-es típusú kollagént tartalmazott. Ha a kollagén fibrilláris mérete nő, a mesenchymális stroma sejtek proliferációja és terjedése csökken, ami a primer újszülöttkori tüdősejtek növekedésének gátlásához vezet (Huang és mtsai., 2010a). Ezért a mesenchymális stróma sejtek niche sejtekként szolgálnak a pulmonális epithelialis őssejtek megújulási képességének közvetlen szabályozására.

Dinamikus funkcionális biointerfészek

Az ECM és a sejtek közötti felismerési és szabályozási mechanizmusok jobb megértése érdekében számos modellrendszert hoztak létre funkcionális önszerveződő monorétegeken (SAM) alapuló modellrendszereket (Roberts et al., 1998; Xiao et al., 1998; Rezania et al., 1999). Az alkanetiolátok SAM-jei aranyfelületeken arginin-glicin-aszpartát (RGD), és oligo(etilénglikol) (OEG) részek keverékeit jeleníthetik meg. Az RGD egy tripeptid, amely a sejtfelszíni integrinreceptorokhoz kötődve elősegíti a sejtadhéziót, az OEG-t pedig általában a fehérjék és sejtek nem specifikus adszorpciójának ellenállására használják. Az RGD tripeptidrészek frakciója és szerkezete lehetővé tette a sejtadhéziós viselkedés manipulálását. A rendszerek bizonyos mértékig lehetővé tették a komplex biológiai aktivitások megvilágítását. Azonban, mint fentebb említettük, a mikrokörnyezetekben az ECM komponensek (pl. fibronektin-kollagén és GAG-kollagén) közötti mechanikai tulajdonságok és molekuláris kölcsönhatások jelentősen meghatározhatják a sejtaktivitásokat. Ráadásul a felszíneken lévő, viszonylag statikus ligandumok nem képesek tükrözni a sejt-ECM kontaktusok dinamikáját.

Miatt, hogy a felszínen véletlenszerűen lerakódó fehérjék nem fogják meghatározni a sejtekkel való kölcsönhatásukat, jól jellemzett platformra van szükség. A szövetekben zajló sejtaktivitások vizsgálatához egy ilyen platformnak több funkcióval kell rendelkeznie, mint például a specifikus ligandumok immobilizálásának képessége, az adszorbeált nem célfehérjék által indukált félrevezető sejtaktivitások megakadályozása, valamint a kiterjesztett és hidratált ECM-szerű szerkezet bemutatása. Így a szubsztrátok funkcionalizálható és nem szennyeződő tulajdonságai lényegessé válnak a sejtnövekedés platformjaként. A számos nem biofouling-képes anyag közül, amelyek erősen ellenállnak a fehérjék nem specifikus adszorpciójának (Ishihara et al., 1998; Chen et al., 2010; Jiang és Cao, 2010), a lipid alapú anyagokat tartják a legjobbnak a biológiai rendszerek számára, mivel sejtmembránszerű mikrokörnyezetet hoznak létre a sejt-sejt és sejt-biomaterial kölcsönhatások vizsgálatához. Különösen a komplex sejt-sejt és sejt-biomateriális kölcsönhatások rendkívül dinamikusak a biomolekulák széles skálájával, téridő-szabályozott módon, mint például a komplex intracelluláris jelátviteli folyamatok és a szerkezeti átrendeződés. Ezeket nem képesek statikus SAM rendszerekkel levezetni. A sejtmembrán és a kapcsolódó folyamatok komplexitásának in vitro nyomon követése érdekében dinamikus szintetikus anyagokat fejlesztettek ki, ahol a ligandok jellemzőinek, például a mobilitásnak, a sűrűségnek és a prezentációnak a szabályozása lehetséges. A modell sejtmembránok, a támogatott lipid kettősrétegek (SLB) alulról felfelé irányuló megközelítést kínálnak a dinamikus funkcionális biofelületek megkonstruálásához, hogy lehetővé tegyék az önszerveződést és a ligandok mobilitását, prezentációját és eloszlását adott helyeken (Kocer és Jonkheijm, 2018). Ezért ennek a cikknek a középpontjában a sejt-ECM kapcsolatok fejlesztése áll funkcionális SLB-k segítségével, hogy megvilágítsa a komplex dinamikus viselkedést a sejtmembránok kulcsfontosságú jellemzőinek és az ECM-ekkel való kölcsönhatásaik kihasználása érdekében. Az SLB-k alapján a tanulmányok kis molekulákkal, például RGD peptiddel (Svedhem et al., 2003; Jensen et al., 2004; Ochsenhirt et al., 2006) és epidermális növekedési faktorral (Nam et al., 2006) módosított funkcionalizált SLB-t építettek a sejtválaszok ellenőrzésére. A mikrokörnyezet hatókörének és komplexitásának kiszélesítése érdekében azonban az ECM-fehérjék funkcionalizált SLB-hez való konjugálásával felépített biomimetikus rendszer jobban alkalmazható az ECM-komponensek és a sejtek közötti kölcsönhatások szemléltetésére. Az SLB-ken lévő ECM komponensek fluiditása, gradiense, mechanikai tulajdonságai, nanostruktúrái, molekulák közötti (pl. kollagén-fibronektin) és molekulán belüli (pl. kollagén fibrillogenezis) kölcsönhatásai meghatározhatók és értékelhetők a mikrokörnyezet tényleges sejtválaszainak feltárása érdekében, ami megkülönbözteti ezt a fajta sejttenyésztési platformot más szilárd anyagokon, például műanyagokon, fémeken, oxidokon és SAM-eken lévő platformoktól. Ezért az SLB robusztus platformot kínál a sejtmembránhoz hasonló egyedi tulajdonságokkal, mint például a szennyeződésmentesség, a hidratáció, az oldaldiffúzió, valamint a ligandumok térbeli elhelyezkedésének és sűrűségének szabályozására való képesség, amely nagy lehetőségeket rejt magában az orvostudomány és a mérnöki tudományok területén (Sackmann, 1996; Groves et al., 2001).

Extracelluláris mátrix-támogatott lipid kétrétegű rendszerek

Az ECM-konjugált SLB-n alapuló biomimetikus sejttenyésztési rendszer úttörő munkáját Chang csoportja végezte (Huang et al., 2010b). Ők egy biomimetikus platformot építettek az I. típusú kollagén SLB-n történő funkcionalizálásával, amely szubsztrátként szolgált a sejtkultúra ellenőrzésére és a sejtek viselkedésének vizsgálatára, Az 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-foszfoetanolamin-N-(glutaril) (DP-NGPE) és 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-foszfokolin (POPC) funkcionalizálható lipidvizikulákat SiO2 hordozóra helyezték, hogy SLB-ket képezzenek (1. ábra). A DP-NGPE, egy karbonsavval funkcionalizált foszfolipid moláris frakcióját az SLB-kben 0 és 40% között változtattuk. Az I. típusú kollagénnel funkcionalizált lipid kettősréteg-összeállítás létrehozásához natív I. típusú kollagénmolekulákat vittünk a kamrába, hogy aktivált DP-NGPE lipidekkel reagáljanak, és aminkapcsolási kémia révén stabil kollagén-lipid konjugátumokat képezzenek amidkötésekkel. A fehérje immobilizációjának kötési kinetikáját és a film jellemzőit – filmvastagság, viszkoelaszticitás, konformáció és folyékonyság – disszipációval ellátott kvarckristály-mikromérleg (QCM-D), atomerő-mikroszkópia (AFM) és fotobleaching utáni fluoreszcencia-visszanyerés (FRAP) segítségével követtük nyomon. Az eredmények azt mutatták, hogy a nagy százalékban DP-NGPE-t tartalmazó funkcionalizált SLB-kre adszorbeálódott kollagén megnövelte a felületi tömegét, viszkoelaszticitását és fibrilláris struktúrákba való önszerveződését. A FRAP adatai azt mutatták, hogy az I-es típusú kollagénnek az SLB-khez való kapcsolódása után a laterális lipidmozgékonyság akár 20%-kal csökkent. A simaizomsejtek (A10) szabályos módon terjedtek és növekedtek a kollagénnel funkcionalizált platformon, ellentétben a kollagén nélküli POPC/DG-NGPE kettősréteggel és a csupasz POPC lipid kettősréteggel. A plazmamembrán és az ECM kulcsfontosságú alkotóelemeit tartalmazó egyszerű, alulról felfelé építkező biomimetikus rendszer lehetőséget nyújt az ECM elemeire és fizikai nyomokra adott sejtes felismerés és válaszok feltárására.

A pontfelbontású vizsgálaton kívül az ECM-SLB rendszerre adott evolúciós sejtválaszokat is vizsgálta ugyanaz a csoport (Huang et al., 2010c). A vizsgálatban a biomimetikus ECM mikrokörnyezeteket I. típusú kollagén és/vagy fibronectin konjugálásával állították elő az aktivált DP-NGPE-t tartalmazó, funkcionalizálható SLB-ken (2. ábra). A fehérjekonjugált rendszereket QCM-D-vel kvantitatívan jellemeztük a felületi tömeg, a viszkoelaszticitás és a kollagén-fibronektin kölcsönhatások szempontjából. A fehérjekonjugációt és a sejtkultúrát követően az SLB mozgékonyságának késleltetését FRAP segítségével mutattuk ki. A párhuzamos összehasonlítás érdekében NIH 3T3 fibroblasztokat tenyésztettünk az ECM-SLB konstrukciókon és oxigénplazmával kezelt polisztirolon (PSo). Az ECM-SLB kultúrákon a fibroblasztok legnagyobb sejtszámát és terjedési méretét a fibronectinnel lerakott SLB-ken találtuk. Mindazonáltal az ECM-bevonatú PSo-n nem figyelhető meg ilyen megkülönböztethető különbség az összes fehérjetartalom között. Ezenkívül az immunfluoreszcens festési adatok azt mutatták, hogy a 3T3 sejtek által endogén módon termelt fibronectin adszorpciós szintje a PSo alapú felületeken nyilvánvalóan nagyobb volt, mint az SLB alapú platformokon. Az eredmények rávilágítanak az alapul szolgáló SLB-k szennyeződésgátló jellegének fontos szerepére abban, hogy megakadályozzák a 3T3 sejtek hatékony átalakítását a mikrokörnyezetükben. Ezzel szemben a sejtek a PSo alapú platformokon az ECM-fehérjék nem specifikus adszorpciója révén könnyen átalakulhatnak. Következésképpen az ECM-SLB platform felhasználható az ECM-összetételekre adott sejtspecifikus válaszok és az azt követő, extracelluláris környezettel való jelátviteli események nyomon követésére és szabályozására.

Cho csoportja a sejtek viselkedését vizsgálta alacsony merevségű SLB-n, amelyet vagy fibronectinnel vagy I. típusú kollagénnel funkcionalizáltak aminkapcsolási kémia segítségével (Vafaei et al., 2017a). A műanyag sejttenyésztő lemezek hagyományosan rendkívül merev szubsztrátot mutatnak, ami nem tükrözheti a sejtek által fiziológiás mikrokörnyezetben tapasztalt valós mechanikai merevséget. A közelmúltban elasztomereket, például polidimetil-sziloxánt (PDMS) használtak széles merevségi tartományok modulálására, amelyek számos fontos betekintést nyújtanak az ECM mechanikai tulajdonságainak a sejtválaszokban betöltött szerepéről (Engler és mtsai., 2006). Mindazonáltal az SLB-rendszerek lehetőséget kínálnak a leglágyabb és legfolyékonyabb határfelületek elérésére, hogy a sejtek tevékenységét fiziológiás környezetben is nyomon követhessük. A lipidvezikulákat egy zwitterionikus 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-foszfatidil-kolinból (DOPC) és DP-NGPE-ből állították össze, majd az oldószerrel segített lipiddiplayer (SALB) képződési módszerrel SiO2 fedőlapokra helyezték (Tabaei et al., 2014; Vafaei et al., 2017b). A hagyományos vezikulafúziós módszertől eltérően, amely a foszfolipid vezikulák spontán adszorpcióját és felszakadását foglalja magában, és csak a lipidösszetételek és szilárd hordozók egy részhalmazára korlátozódik (Huang és mtsai., 2010a,b,c), a SALB-képzési módszer a fordított fázisú párolgás jelenségén alapul, és a lipidek lerakódását hidrofil szilárd felületre alkoholban végzi (Tabaei és mtsai., 2014). A SALB módszert sikeresen alkalmazták a legkülönbözőbb szubsztrátokon, például Au, Al2O3 és grafén esetében, amelyek a hagyományos módszerrel nehezen kezelhetőek (Tabaei et al., 2014; Jackman et al., 2015). Az I. típusú kollagén és a fibronektin ECM-fehérjéket kémiailag konjugálták a SALB által segített SLB-kre. QCM-D vizsgálatokat végeztek, és megállapították, hogy az SLB-n lévő ECM-ek kevésbé sűrűek és nagyobb szerkezeti rugalmassággal rendelkeznek, mint SiO2-re adszorbeálva (Vafaei és mtsai., 2017b).

Az SLB-alapú alacsony merevségű hordozót továbbá I. típusú kollagénnel vagy fibronektinnel funkcionalizálták sejtadhéziós vizsgálatokhoz (Vafaei és mtsai., 2017a). Az SLB laterális fluiditását az SLB-ben lévő DP-NGPE és koleszterin moláris frakciójának szabályozásával finoman hangoltuk. A sejtek specifikus adhézióját a kettősrétegen a fluoreszcens képek alapján az ECM-fehérjék feldúsulása és a sejtek körül egy kimerülő zóna megjelenése jelezte. A magas koleszterintartalmú kettősrétegeken a sejtek >10%-a mutatott kiürülést akár a fibronektin, akár a kollagén tekintetében. Ez az ECM-fehérjék csökkent laterális mozgásának tulajdonítható, amelyet az alapul szolgáló kettősréteg viszkozitása szabályoz. Ezért az ECM-SLB platform koleszterin hozzáadásával különböző szubsztrátmerevségeket biztosít olyan potenciális orvosbiológiai alkalmazásokhoz, amelyekben a sejtek rendkívül alacsony merevségű felületekhez, például neuronális szövetekhez kell tapadniuk.

A sejtmikrokörnyezetet jobban utánzó platform kifejlesztése érdekében egy SLB-t természetes decellularizált extracelluláris mátrixszal (dECM) funkcionalizáltak, amely megtartja a 3D-ultrastruktúrát és támogatja a humán hepatocita Huh 7.5 túlélését és kötődését (3. ábra) (Vafaei et al, 2018). A dECM-et egér tetemekből vonták ki, és kloroform/metanol oldat keverékével decellularizálták. A dECM GAG-okat, kollagént és fibronektint tartalmaz. A dECM komponenseket kémiailag a DP-NGPE-t és DOPC-t tartalmazó SLB-hez kötöttük aminkapcsolási kémia segítségével. A QCM-D-t a kettősréteg kialakulásának és az azt követő dECM-lerakódás kinetikájának nyomon követésére használtuk. A FRAP eredmények megerősítették a membrán folyékonyságát a dECM-mel történő funkcionalizálást követően. A platform támogatja a sejtek túlélését és rögzülését, és fenntartja a reprezentatív hepatocelluláris funkciót. Feltűnő volt a növekedési faktor receptorok és sejtkötő ligandumok laterális klasztereződése és szerveződése a gazdag biokémiai profillal rendelkező szöveti eredetű dECM komponensek jelenlétében a platformon.

Hao és munkatársai beszámoltak egy ECM-SLB mechanikai tulajdonságainak hatásáról az idegi őssejtek (NSC-k) differenciálódására (Hao et al., 2018). Az SLB-ket tenyésztési platformként használták a folyékony ECM dinamikus jellemzőinek utánzására. Az SLB-k fluiditását a szubsztrátumok felületi tulajdonságaival finoman variáltuk. Az SLB-k 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-foszfo-etanolamin-N-(7-nitro-2-1, 3-benzoxadiazol-4-il) (NBD-PE), 1,2-dimirisztoil-sn-glicero-3-foszfokolin (DMPC) és 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-foszfo-etanolamin-N-(szukcinil) (Szukcinil-PE) tartalmúak. A FRAP-mérések alapján a piranha-kezelt üvegen (P-SLB) lévő SLB nagyobb folyékonyságot mutat, mint a koleszteril-kloroformát tetherrel módosított üvegen (CC-SLB) vagy kitozánnal módosított üvegen (Cs-SLB) lévő SLB. Ezenkívül a CC-SLB fluiditása valamivel alacsonyabb volt, mint a Cs-SLB-é. A fibronektint ezt követően fizikailag adszorbeálták a különböző hordozókon lévő SLB-ken. Az eredmények azt mutatták, hogy az NSC-k viselkedése nagymértékben összefügg az SLB-k fluiditásával. Az alacsony fluiditású SLB-n fokozott fokális adhéziót, megnyúlt és megnyúlt sejtmorfológiát, sűrű stresszrost-hálózatot és fokozott neuronális differenciálódást figyeltünk meg. Ezzel szemben a magas fluiditású SLB-n kevesebb fókuszos adhéziós képződést, kerek sejtmorfológiát, éretlen stresszrostokat és több asztrocita differenciálódást találtunk. Mechanisztikus vizsgálatokban kimutatták, hogy a FAK-MEK/ERK jelátviteli útvonalak aktiválása kulcsfontosságú útvonal a fokozott fókuszos adhéziós képződéshez, és végül elősegítette az NSC-k neuronális differenciálódását az alacsony fluiditású SLB-n. A munka betekintést nyújtott a dinamikus ECM őssejtek viselkedésére gyakorolt hatásába, valamint javítja az őssejt-alkalmazások hatékonyságát.

A SLB-kre kötött liposzómákat DNS-hibridizációra (Benkoski és Hook, 2005; Yoshina-Ishii és mtsai., 2005), biotin-streptavidin kötésre (Patel és mtsai., 2009) és hatóanyag-leadásra (Tseng és Chang, 2012) hozták létre. A kötött liposzómás rendszereket alkalmazták membránfehérjék rekonstitúciójára fehérje-lipid és fehérje-fehérje kölcsönhatások tanulmányozására, valamint fehérjék kapszulázására egyetlen biomolekula kimutatására. Az ECM-SLB-ket tartalmazó biomimetikus konstrukciót polietilénglikollal (PEG), fibronectinnel és koleszterint tartalmazó liposzómákkal alakították ki (Tseng és Chang, 2012). Az SLB-k funkcionális 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-foszfoetanolamin-N-cap-biotinil (b-PE) és zwitterionikus POPC-ból készültek. A hatóanyag-kapszulázott liposzómákat a biotin-streptavidin kölcsönhatás révén immobilizáltuk (4. ábra). A liposzóma-SLB konstrukció multifunkcionális platformként szolgál a hatóanyag-felszabadításhoz és a sejtek rögzítéséhez. A fibronectin-liposzóma-SLB modellplatform kialakulását in situ QCM-D-vel követtük nyomon. A felülethez kötött liposzómák SLB-ken való kiváló stabilitását egy kapszulázott fluoreszcens szondán keresztül értük el. Azt mutatta, hogy < a fluoreszcens szonda tartalmának 20%-a 8 nap alatt felszabadult. A sejtkölcsönhatások vizsgálatához HeLa sejteket tenyésztettünk a fibronectin-liposzóma-SLB platformon. A fibronectin kritikusnak bizonyult a HeLa sejtek adhéziójának fokozásában a platformokon. Ezért a sejtadhéziót követően a liposzómák térben átrendeződtek, és a sejtek bekebelezték őket. A doxorubicinnel töltött liposzómák felületi sűrűsége határozza meg a HeLa sejtek apoptózisát, ami megerősíti a liposzómák általi hatóanyag-leadás hatékonyságát. Ezért a multifunkcionális modellplatform előnyös lehet előre beadott, szabályozott hatóanyag-leadású rendszerként sejt- és szövetalapú vizsgálatokhoz.

A GAG-ok az ECM-fehérjék mellett számos funkciót látnak el a szövetekben, többek között támasztékot nyújtanak, közvetítik a sejtek differenciálódását és osztódását, és fontos kölcsönhatásokban vesznek részt a fehérjékkel. A GAG-okkal kapcsolatos kölcsönhatások megértése eleve nehéz, és megfelelő és meghatározott platformokat igényel. Svedhem és munkatársai két immobilizációs stratégiát mutattak be a GAG kondroitin-szulfát (CS) folyékony SLB-khez való kémiai párosítására: 1. a CS karboxilcsoportjainak aktiválásával egy amino-funkcionalizált lipid hozzáadása előtt, ill, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-foszfoetanolamin-N-(lauroilamin) (DOPE-NH2); 2. karboxifunkcionalizált foszfolipidek, például 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-foszfoetanolamin-N-(lauroil) (DOPE-COOH) aktiválásával, majd hidrazid-funkcionalizált CS hozzáadásával (Altgarde et al., 2013). Az SLB-k kialakulását és az azt követő konjugációt in situ követtük QCM-D segítségével. Az eredmények azt mutatják, hogy a két stratégia hasonló viszkoelasztikus tulajdonságokkal rendelkező vékony CS-filmeket eredményezett. A lipid kettősréteg fluiditását nem befolyásolta a CS konjugálása. Így a kifejlesztett CS platform SLB-ken történő alkalmazását a csontindukáló növekedési faktor, a csontmorfogenetikus protein-2 esetében példáztuk.

Összefoglaló és kilátások

A sejtek növekedéséhez és szabályozásához szükséges mikrokörnyezetek létrehozása in vitro továbbra is kihívást jelent. Az ECM-ek komplexitása hiányzott a rendszeres sejttenyésztési rendszerekből, amely magában foglalja a fluiditást, a gradienst, a mechanikai tulajdonságokat, a nanoszerkezeteket, valamint a molekulák közötti és molekulán belüli kölcsönhatásokat. Az ECM komponensekkel konjugált biomimetikus SLB rendszer némi fényt vetett az in vivo mikrokörnyezetben a tényleges sejtválaszokra. Az SLB egyedülálló tulajdonságokkal rendelkezik a folyékonyság, a szennyeződésekkel szembeni ellenállás, a sokoldalúság és a biokompatibilitás tekintetében. Eddig nem találtunk olyan alternatívát, amelyet ugyanerre a célra lehetne használni. Az SLB-ECM platformok fizikai tulajdonságai egyértelműen meghatározhatók olyan fejlett eszközök alkalmazásával, mint a QCM-D, az AFM és a FRAP, a sejtválaszok korrelálása érdekében. Ezenkívül a sejtek dinamikus viselkedését az SLB-ECM platformokon érdemes lenne követni, mivel az ECM összetétele és struktúrája tartósan változik a sejtek növekedésével. Az SLB-ECM platformon a kutatók megfigyelhetik a sejtek és mikrokörnyezetük közötti specifikus felismerési kölcsönhatásokat a biológiai tevékenységek közvetlen lefordítása érdekében a mesterséges tenyésztési rendszeren. Az alapvető vizsgálatokon túlmenően az SLB-ECM platformról úgy vélik, hogy hasznos lehet különböző alkalmazásokban, például a gyógyszerek szűrésében, ritka sejtek befogásában, a regenerációs gyógyászatban és a bioszenzálásban.

A szerzők hozzájárulása

C-JH felelős az irodalomkeresésért és az írásért. Y-CC felelős az írásért és az átdolgozásért.

Finanszírozás

MOST 105-2628-E-008-007-MY3; 106-2119-M-194-002; 107-0210-01-19-01; 107-2119-M-001-039 a Tudományos és Technológiai Minisztérium (MOST), Tajvan, és az Academia Sinica, Tajvan.

Enyilatkozat az összeférhetetlenségről

A szerzők kijelentik, hogy a kutatást olyan kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolatok hiányában végezték, amelyek potenciális összeférhetetlenségként értelmezhetők.

Köszönet

Megköszönjük a Tudományos és Technológiai Minisztériumnak (MOST 105-2628-E-008-007-MY3; 106-2119-M-194-002; 107-2119-M-001-039) a projekt pénzügyi támogatását.