Tn5 mutáns könyvtár építése
A Tn5 mutánsokat a teljes vad típusú Tn5 transzpozázon (NCBI hozzáférési kód: “3ECP_A”, Additional file 1) végzett véletlenszerű mutagenezissel, hibás PCR segítségével hoztuk létre. A hely telítését a fehérje modellezett DNS-kötőhelyén végeztük el. A mutagenizált Tn5 fragmentumokat módosított pET11a vektorba illesztettük be E. coli-ban történő expresszió céljából (Illumina Madison). A vektor a plazmid stabilitása érdekében kanamizinrezisztens, és a T7 promóter/lac operon után a Tn5 kódoló régió N-terminálisánál a tisztítás megkönnyítése érdekében Strep Tag II-sumo fúzióval rendelkezik. A lineáris regresszióval azonosított driver mutációkat standard site-directed mutagenezissel (Qiagen) kombináltuk.
Mutáns fehérje expresszió és tisztítás
A mutáns könyvtárat beoltottuk, egyes kolóniákat szelektáltunk, hogy beoltjuk 1 L Luria Broth (LB) táptalajon 50 μg/mL kan-t, és hagytuk, hogy OD600 = 0,5-ig növekedjen. A Tn5 mutáns transzpozázok expresszióját ezután 100 μM izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozid (IPTG) hozzáadásával indukáltuk, majd 18 °C-on 19 órán keresztül inkubáltuk.
A sejteket centrifugálással szüreteltük és TNE1 pufferben (100 mM Tris, pH 8,0, 1 M NaCl, 1 mM etiléndiamin-tetraecetsav (EDTA), 1 mM ditiotreitol (DTT)), amely teljes proteáz-inhibitor keveréket (Roche) tartalmazott, reszuszpendáltuk. Üveg homogenizálót használtunk a sejtpellet felbontására, mielőtt háromszor átengedtük egy mikrofluidizátoron a lízishez. A lizátumhoz nátrium-deoxikolátot adtunk (0,1% végleges), és az elegyet szobahőmérsékleten, keverés közben 15 percig inkubáltuk, majd 15 percig 4 °C-on. 4 °C-on történő keverés közben 5% polietilénimin, pH 7,5-t adtunk az elegyhez (0,5% végleges), és további 1 órán át kevertettük a nukleinsavak kicsapásához, amelyeket centrifugálással távolítottunk el (45 000 g 20 percig 4 °C-on). A felülúszóhoz 1:1 arányban telített ammónium-szulfátot adtunk, és az elegyet 4 °C-on 1 órán át kevertettük, majd centrifugáltuk (45 000 g-n 20 percig 4 °C-on). A Tn5 mutáns fehérjéket tartalmazó pelletet 10 ml TNE1-ben reszuszpendáltuk, centrifugáltuk a részecskék eltávolítása érdekében, majd a kapott felülúszót 5× TNE1-gyel tovább hígítottuk, és egy StrepTrap High Performance (HP) oszlopra (GE Healthcare) töltöttük, amelyet AKTA Pure (GE Healthcare) segítségével TNE1-gyel egyensúlyoztunk.
A betöltés után a StrepTrap HP oszlopot 10 oszloptérfogattal (CV) 100 mM Tris, pH 8,0, 4 M NaCl, 1 mM EDTA-val mostuk, majd 10 CV 100 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA-val. Ezután a fehérjét 10 CV gradienssel eluáltuk 100 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM Desthiobiotin (IBA-lifesciences) felhasználásával. Az OD280-as csúcsokat tartalmazó frakciókat összevontuk, és egy HiTrap Heparin HP oszlopra vittük, amelyet 100 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,2 mM EDTA (GE Healthcare) egyensúlyba hoztunk. A kötés után az oszlopot 15 CV kiegyenlítő pufferrel mostuk, majd 20 CV sógradienst (100 mM-1 M NaCl) alkalmaztunk. A 0,5 M NaCl-nál egyetlen eluált csúcsról nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) kimutattuk, hogy a Strep-Sumo-Tn5 mutánsokat tartalmazza 66 kDa-nál. Az eluált csúcsot 10 kDa MWCO-val rendelkező Vivaspin 20 centrifugális koncentrátorban koncentráltuk, majd -20 °C-on történő tárolás céljából 1:1 arányban 100%-os glicerinnel hígítottuk. Ebből az expresszióból és tisztításból a Tn5 mutáns transzpozázok hozama körülbelül 5 mg volt 1 L kultúránként.
Transzposzóma-összeszerelés és aktivitás normalizálás
A 19 bp-os Tn5 mozaikvég (ME) transzpozon szekvenciát (amely tartalmazza a 14 és 15 bp-os 5′ adaptor szekvenciát is, amely kompatibilis az Illumina páros végű szekvenálással) az egyszálú oligókat 5 percig 95 °C-on melegítve, majd a hőmérsékletet 2 percenként 5 °C-kal csökkentve 20 °C-ra. Az annealizált ME-ket tisztított Tn5 transzpozázzal kombináltuk 1,2:1 moláris arányban (ME:transzpozáz), és 37 °C-on inkubáltuk 1 órán át. Az így kapott transzpozóma-összeállítást felhasználásig -20 °C-on tároltuk.
A mutánsok címkézési aktivitását a Nextera DNS könyvtárkészítési módszerben (Illumina) megadott standard módszerrel és reagensekkel normalizáltuk. Röviden, 25 ng B. cereus genomi DNS-t (gDNS) jelöltünk meg különböző koncentrációjú mutánsokkal vagy kontrollként az Illumina Nextera kitből származó standard Tn5-tel. Az így kapott fragmentált DNS méretét az Agilent High Sensitivity DNS bioanalizátor chipjén elemeztük. A Tn5 mutánsok koncentrációit ezután normalizáltuk, hogy azonos DNS-fragment méreteloszlást érjünk el, ahol a görbe alatti terület 100 és 300 bp között 20-30%, 301-600 bp között 30-40%, 601-7000 bp között 30-40%, míg a teljes görbe alatti terület 100 és 7000 bp között ≥90% volt (Additional file 2: S1 ábra).
DNS könyvtárkészítés, szekvenálás és adatelemzés
Minden Tn5 mutáns transzposzómából 5 μL-t használtunk normalizált koncentrációban E. coli gDNS (kiegyensúlyozott genom), R. sphaeroides (GC gazdag genom) és B. cereus genomi DNS (AT gazdag genom) szekvenáló könyvtárak készítéséhez a standard Nextera DNS könyvtárkészítési módszerrel. A könyvtárakat ezután az Illumina standard protokollját követve szekvenáltuk MiSeq-en. A torzítási ábrákat úgy állítottuk elő, hogy megszámoltuk, hogy az egyes nukleotidokat hányszor figyeltük meg minden ciklusban az összes leolvasás esetében, és ezt százalékban jelentettük. A Bias plot megmutatja a transzpozíciók általános címkézési torzítását. Megjegyzendő, hogy az egyes pozíciók torzítása független lehet a többi pozíciótól. A lefedettségi ábrák a különböző szekvenálási mélységben megfigyelt bázisok százalékos arányát mutatják. Ezeket a samtools mpileup opciójával (http://www.htslib.org/) hoztuk létre. A normalizált GC-görbéket és az AT/GC kieséseket a Picard Tools (http://broadinstitute.github.io/picard/) segítségével generáltuk.
Lineáris regresszió
Lineáris regressziós modelleket használtunk az egyes mutációknak az inszerciós torzításban betöltött súlyának becslésére. Minden lineáris regressziós modellt a leolvasott bázispozícióban lévő domináns nukleotid tartalmára alkalmaztunk, így bázispozíciónként egy modellt kaptunk. A modellek illesztéséhez E. coli szekvenálási eredményeket használtunk. Ezért a következő nukleotidokat használtuk domináns nukleotidként az 1. és 15. bázispozíció között: GTTTA***CTGTGTGCG. Mivel a Tn5 homodimerként viselkedik, a 6-9. pozíciókban megfigyelt domináns nukleotidok mindig komplementer bázisok az 1-4. pozíciókban lévőkhöz képest. Ezért a 6., 7. és 8. bázisok modelljeit figyelmen kívül hagytuk, de a 9. bázispozíciót megtartottuk. Bár a 9-es pozíció a szimmetria miatt megismétli az 1-es pozíció viselkedését, az 1-es pozíciót befolyásolják a szekvenálási artefaktumok, ezért a 9-es pozíciót használjuk, hogy jobban megragadja az 1-es pozíció jellemzőit.
A képzéshez tízszeres keresztvalidálást használtunk, és a súlyokat átlagoltuk a 10 kereszttréning során. A prediktorváltozók bemeneti mátrixa az egyes mutánsok soraiból és az összes megfigyelt mutáció oszlopaiból állt. A mindig együtt megjelenő mutációk szingularitást okoztak a mátrixban. Ezért az ezekhez a mutációkhoz tartozó oszlopok közül egy kivételével az összeset kihagytuk. A súlyvektorok megoldására a legkisebb négyzet módszerét alkalmaztuk.
Minden pozícióhoz kiválasztásra kerültek azok a mutációk, amelyek jelentős pozitív vagy negatív súlyokkal rendelkeztek. A különböző pozíciókból származó mutációk kombinálásával új mutánskönyvtárat hoztunk létre. Ezért a mutációkat a hasonló hatás alapján csoportosítottuk. A csoportok tartalmazhatnak olyan közös mutációkat, amelyek egyszerre több pozícióra is hatással vannak.
Tn5/DNS-kötés stabilitásának vizsgálata
A standard Tn5-ről kimutatták, hogy a címkézés után is kötődik a cél-DNS-hez (nem publikált eredmények). Ezért a tagmentált DNS polimerázzal történő réskitöltését és a DNS PCR-rel történő további amplifikációját a sztérikus akadályozás megakadályozza. A Tn5 azonban emelt hőmérsékleten disszociál a jelölt DNS-ről, így lehetővé teszi a további réskitöltést és a DNS polimerázzal történő PCR-elését. A polimeráz PCR-reakciójának lehetővé tételéhez szükséges hőmérséklet így felhasználható a különböző Tn5 mutánsok Tn5/DNS-kötési stabilitásának összehasonlítására. Minél magasabb hőmérséklet szükséges, annál stabilabb a komplex.
A Tn5-059 mutánst vagy a standard Tn5-öt B. cereus gDNS jelölésére használtuk 1 mL reakcióban a standard Nextera protokollt követve, kivéve, hogy a TD puffert 20 mM Tris-acetát pH 7,5, 5 mM magnézium-acetátra cseréltük. A TD puffer magnéziumot tartalmaz, így ez nem okozhat extra kombinált hatást a mutációkkal az inszerciós torzítás megváltoztatására. A 25 μL-es reakcióból háromszoros adagolást végeztünk egy PCR-lemezbe, és 55 °C-on inkubáltuk 5 percig, majd centrifugáltuk (1000 g 5 percig 4 °C-on).
A PCR-t tartalmazó második lépéshez PCR-keveréket készítettünk 200 μL PPC (PCR-primer-koktél), 200 μL i501, 200 μL i507 és 400 μL NPM (a standard Nextera DNS-könyvtárkészítő készletben található reagensek) kombinálásával. Ebből a keverékből 25 μL-t adtunk a PCR-lemezen lévő minden egyes 25 μL-es tagmentációs reakció aliquotjához, majd pipettával összekevertük, és visszatettük a termocyclerbe. A lemez 12 oszlopán 72 °C és 95 °C közötti hőmérsékleti gradienst hoztunk létre, és 1 percig tartottuk, majd a lemezt 5 percig 72 °C-on inkubáltuk, majd 30 másodpercig 98 °C-on. Ezt a hézagkitöltési-denaturálási lépést követően a Nextera DNS-könyvtárkészítési módszerben meghatározott 5 PCR-ciklust hajtottuk végre. Ezután a lemezt 1000 g-nél 5 percig 4 °C-on centrifugáltuk. Ezután minden egyes tagmentációs-PCR amplifikált reakciót Zymo Clean and Concentrator 96 lyukú lemezzel tisztítottunk, és 25 μL 10 mM Tris, pH 8,0-val eluáltunk. Háromszoros negatív kontrollmintát készítettünk a standard címkézési protokoll szerint, beleértve a Zymo tisztítást a Tn5 transzpozáz eltávolítására, de a PCR lépés nélkül. A pozitív kontroll háromszorosát a standard címkézési protokoll szerint készítettük el, beleértve a Zymo tisztítást a Tn5 transzpozáz eltávolítására és a PCR lépést a címkézett DNS felerősítésére. Ezután minden tisztított DNS-terméket 1:10 arányban hígítottunk 10 mM Trisben, pH 8,0-ban, majd Picogreen és lambda DNS-standard segítségével kvantitáltuk.
Az eredmények azt mutatták, hogy a standard Tn5 74,2 °C-on, míg a Tn5-059 76,6 °C-on válik le a címkézett DNS-ről, és így lehetővé teszi a későbbi réskitöltést és PCR-reakciókat (Additional file 3: S2 ábra). A Tn5-059 esetében szükséges magasabb hőmérséklet egy stabilabb DNS-kötő komplexet jelzett.