Kinetikusan korlátozott differenciális centrifugálás, mint a centrifugális eluálás olcsó és könnyen elérhető alternatívája

A célsejtek elválasztása más, hasonló sűrűségű, de (kis mértékben vagy jelentősen) eltérő méretű sejteket tartalmazó keverékekből számos alkalmazásban kívánatos. Ilyen például a szinkronizált sejtkultúrák előállítása, ahol a sejteket a ciklusuk egy adott (méretükkel jellemezhető) szakaszában izoláljuk (1-2), a kortikotrop sejtek elkülönítése más hipofízis sejtektől (3) és a monociták különböző alpopulációinak szétválogatása (4). A sejtpopulációknak a szedimentációs sebesség különbségei alapján történő elkülönítésére (különösen, ha a sűrűségkülönbségek nem jelentősek) a centrifugális elutriálásnak nevezett eljárás a legmegfelelőbb módszer (5). Itt a szeparálóanyagokat (általában sejteket) két erőnek vetjük alá: (i) egy centrifugális erő, amely a sűrűségük és méretük függvényében meghatározott sebességű üledékképződésre készteti őket, és ii) egy ellenkező irányú konvektív áramlás, amely az összes sejtnek állandó sebességet kölcsönöz. Az áramlás és/vagy a centrifugálási sebesség beállítható úgy, hogy csak azokat a sejteket gyűjtsük össze, amelyeknek az ülepedési sebessége egy adott tartományba esik. Bár ezt az eljárást sikeresen alkalmazták a baktériumsejtek elválasztására az őket tartalmazó mátrixokból (6) (ez az általunk vizsgált alkalmazás), a speciális berendezések szükségessége sok laboratórium számára akadályt jelent.

Noha számos protokollt írtak le a baktériumok izolálására különböző mátrixokból, például élelmiszerekből (7-8), talajból (9) és mikrobiális szőnyegekből (10), amelyek könnyen hozzáférhető asztali centrifugákat használnak a sejtek elkülönítésére a különböző ülepedési sebességek alapján, az ajánlott protokollok gyakran ad hoc jellegűnek tűnnek. Például Wang és munkatársai (8) a lágysajtból származó baktériumok izolálásakor a törmelék eltávolítására <1000×g-nél meghatározatlan ideig tartó centrifugálást javasoltak, majd a baktériumok összegyűjtésére 9000×g-nél 3 percig tartó centrifugálást. Hasonlóképpen, a homogenizált húsból történő baktériumizoláláshoz Neiderhauser és munkatársai (7) 100×g-on történő centrifugálást javasoltak (meg nem határozott ideig) az ételmaradékok eltávolítására, majd 3000×g-on történő centrifugálást (szintén meg nem határozott ideig) a baktériumok összegyűjtésére. Más esetekben az ajánlott protokollok többszöri centrifugálást tartalmaznak. Például a mikrobiális szőnyegekből származó baktériumok izolálásához Bey és munkatársai (10) nemcsak az 500×g-nél 15 percig tartó centrifugálást javasolják, hanem az üledék újraszuszpendálását és az eljárás négyszeri megismétlését is. Hasonlóképpen, talajból történő baktériumok izolálásához Bakken (9) a minta homogenátumának ismételt (“többszöri”) centrifugálását ajánlja 630-1060×g-on (meg nem határozott ideig), majd a minta újrafelszuszpendálását és rehomogenizálását. Hasonló megközelítéseket javasoltak a baktériumok “pozitív” vértenyésztési táptalajból történő izolálására is. Stevenson és munkatársai (11) a baktériumok azonosságának MALDI-TOF tömegspektrometriás meghatározását megelőzően tiszta baktériumizolátumok előállításához többlépcsős centrifugálási eljárást alkalmaztak, amely egymást követő “1-2 perces”, 8500, 1000 és 13 000 fordulat/perc (g-ben kifejezett érték nincs megadva) centrifugálási lépéseket tartalmazott, a pellet különböző pufferekben történő reszuszpendálásával minden egyes lépésnél.

Ezek az idézett protokollok korántsem az egyetlen példák az ad hoc centrifugálási protokollokra, amelyeket a centrifugálási sebességek és/vagy idők látszólag önkényes megválasztása jellemez. Az ilyen ad hoc protokollok fontos következménye, hogy nem nyújtanak olyan racionális alapot, amely alapján mások protokollokat dolgozhatnának ki különböző célsejtek más mátrixokból/sejtkeverékekből történő izolálására. Például intuitív módon nyilvánvaló, hogy a hosszan tartó centrifugálás az összes részecske leülepedését eredményezi, míg a rövid ideig tartó centrifugálás csak a leggyorsabb részecskéket ülteti le, a legtöbb lassabb részecske pedig a szuszpenzióban marad. A centrifugálás optimális sebességének/idejének meghatározása a célrészecske izolálása és a többi részecske eltávolítása érdekében azonban még mindig inkább művészet. Más szóval, a jelenleg közölt protokollok nem nyújtanak racionális alapot a módosításhoz (az optimális centrifugálási sebességek/idők meghatározásához) más kapcsolódó elválasztási/izolálási célok esetén.

Anyagok és módszerek

elmélet

Az általunk javasolt módszert két olyan részecsketípus elválasztására, amelyek hasonló sűrűségűek, de méretkülönbségek miatt eltérő szedimentációs sebességgel rendelkeznek, az 1. ábra szemlélteti. Az eljárás elején (1. ábra (1)) a szeparánsokat (fehérvérsejtek vagy WBC-k, vörösvérsejtek vagy RBC-k, vérlemezkék és baktériumok) tartalmazó szuszpenziót (esetünkben vértenyésztő táptalaj) külön rétegként egy tiszta, sűrű puffer (esetünkben Histopaque 1083) tetejére töltjük. A puffer sűrűsége nagyobb, mint a WBC-ké (ρ = 1,06-1,08 g/ml (12)) és a vérlemezkéké (ρ = 1,05-1,07 g/ml (13)), de kisebb, mint a RBC-ké (ρ = 1,1 g/ml (14)) és a baktériumoké (ρ = 1,105 g/ml az Escherichia coli esetében (15)). A centrifugálás során minden részecske lefelé tolódik, először a felső rétegen (vértenyésztő közeg) keresztül, majd a sűrű pufferbe (a Histopaque). Míg a pufferénél nagyobb sűrűségű részecskék (vörösvérsejtek és baktériumok) mind a vértenyésztő táptalajon, mind a sűrű pufferen keresztül ülepednek, a kevésbé sűrű szeparánsok (vörösvérsejtek és vérlemezkék) az utóbbiból kizáródnak. Ez az eljárás hasonló a WBC-k és vérlemezkék teljes vérből történő elválasztására ajánlott protokollhoz (16). A mi célunkhoz azonban ez az eljárás önmagában nem elegendő, mert míg néhány nemkívánatos részecskét (WBC-k és vérlemezkék) a sűrűségkülönbségek alapján eltávolítunk a célrészecskéktől (baktériumok), más, hasonló sűrűségű részecskék (RBC-k) megmaradnak. Ahhoz, hogy elérjük célunkat, azaz az összes célsejt (baktérium) összegyűjtését, miközben az összes megmaradt nemkívánatos részecskét (RBC-k) eltávolítjuk, azt javasoljuk, hogy vigyük a rendszert az 1(4) ábrán látható állapotba, és ott állítsuk meg a centrifugálási folyamatot. Ebben az állapotban az összes RBC, amelyek nagyobb méretük miatt nagyobb ülepedési sebességgel rendelkeznek, pelletként a cső aljára kerül, míg az összes baktériumsejt a sűrű pufferben diszpergálódik.

Ezért a kívánt állapot eléréséhez azonban számos megkötésnek kell teljesülnie. Először is, annak érdekében, hogy az összes baktériumot összegyűjtsük a pufferben, elegendő időt kell hagynunk arra, hogy a felülről induló baktériumok (A sík) átvándoroljanak a vértenyésztőleves rétegén (Medium 1) és a Histopaque-ba (Medium 2). Matematikailag ez azt jelenti, hogy:

ahol t az az idő, amely alatt a centrifugálási folyamat lefut, l1 a betöltött vértenyésztőleves oszlop hossza, és vb1 a baktériumok ülepedési sebessége ebben a rétegben. Ezt az időpontot (amikor az A síkból induló baktériumok éppen átlépték a B síkot és belépnek a pufferbe) az 1. ábra (2) ábrázolja.

Az állapot másik kiemelkedő jellemzője, hogy a baktériumok és az RBC-k ekkorra már nem feltétlenül képeznek különálló “sávokat” a pufferben. Míg a bármelyik vízszintes síkból kiinduló RBC-k tovább vándorolnak, mint a hasonlóan elhelyezkedő baktériumok, az A síkból kiinduló RBC-k nem biztos, hogy megelőzték a B síkból (a két folyadék közötti határfelület) kiinduló baktériumokat. Ahhoz, hogy ez megtörténjen, és az RBC-k és a baktériumok különálló sávokat alkossanak a pufferben, a pufferoszlopnak kellően hosszúnak kell lennie. Nem lehetséges a különálló sávok kialakulása, ha például a pufferoszlop csak olyan mélyre nyúlik, mint az 1. ábra (2) bekezdésében szaggatott vonallal jelzett szint. Matematikailag az a feltétel, hogy az A síkról induló vörösvértestek (gyorsabban ülepedő részecskék) megelőzzék a B síkról induló baktériumokat (lassabban ülepedő részecskék), a következőképpen fejezhető ki:

ahol l1 és l2 a vértenyésztő táptalaj (Medium 1) és a puffer (Medium 2) oszlopainak hossza; vR1 és vR2 az RBC-k ülepedési sebessége a táptalajban, illetve a pufferben; és vb2 a baktériumok ülepedési sebessége a pufferben. A fenti egyenlet átrendezhető, így kapjuk:

Az lenne kívánatos, hogy az eredetileg a Medium 1-ben lévő összes baktériumot a Medium 2-ben gyűjtsük össze. Ez azt jelenti, hogy mire a felülről induló baktériumok (A sík) átlépik a két fázis közötti határfelületet (B sík), addig a B síkról induló baktériumok nem érhetik el az alját. Matematikailag ez a feltétel a következőképpen fejezhető ki:

ahol vb1 a baktériumok ülepedési sebessége a Medium 1-ben. A fentieket átrendezve a következő eredményt kaphatjuk:

Ha a (3) és (5) egyenletek teljesülnek, akkor a rendszer eléri az 1(4) ábrán látható állapotot, amelyben az összes RBC elérte a cső alját és külön réteget alkot, de a baktériumok egyike sem tette ezt meg. (Mindannyian a 2. közegben vannak). Ez az állapot először akkor következik be, amikor az összes RBC (még az A síkról induló is) elérte a cső alját. Matematikailag ez az időpillanat (t1) a következőképpen ábrázolható:

Az állapot akkor szűnik meg, amikor a baktériumok (a kezdetben a határfelületen, azaz a B síkban lévő baktériumok) elkezdik elérni a cső alját. Ennek bekövetkezési idejét (t2) a következő adja:

Az optimális elválasztás érdekében tehát (i) biztosítani kell, hogy a két közeg oszlophossza megfeleljen a (3) és (5) egyenleteknek; és (ii) hogy a szedimentációs folyamat lefutásának időtartama (tcentrifugálás) a következő legyen:

A centrifugálás t2-nél hosszabb ideig történő folytatása az 1(5) ábrán látható helyzetet eredményezi, ahol a baktériumok egy része vagy az összes baktérium is leülepedik az aljára. Ahhoz, hogy a kívánt fajok tiszta izolátumaihoz jussunk, a centrifugálási folyamatot az 1(4) ábrának megfelelő szakaszban le kell állítani, a felső réteget el kell dobni, és a sűrű puffert az alján lévő üledék megzavarása nélkül le kell húzni. Kívánt esetben a célrészecskék centrifugálhatók és más közegben reszuszpendálhatók.

Ezt a t1 és t2 közötti “működési ablakot” a 2. ábra vázlatosan ábrázolja. Itt az abszcissza a centrifugálás idejét mutatja, míg az ordináta a sűrű pufferben (Medium 2) lévő RBC és baktérium részecskék frakcióját mutatja. Mindkettő esetében a frakció kezdetben emelkedik, ahogy a felső rétegből vándorolnak befelé, egy ideig állandó marad, ahogy sávosan vándorolnak a sűrű pufferben, és végül csökken, ahogy leülepednek az alján. A gyorsabban mozgó RBC-k esetében meredekebb az emelkedés/csökkenés meredeksége, valamint rövidebb az az időszak, amikor az összes RBC jelen van a sűrű pufferben. A “működési ablak” (felhős doboz) alatt gyakorlatilag minden baktérium (∼100%) jelen van a pufferben, de gyakorlatilag nincs RBC (∼ 0%).

Az RBC-k és a baktériumok ülepedési sebességei (amelyek meghatározzák a 3., 5. és 8. egyenletek által megadott kényszerértékek számértékeit) megjósolhatók a megfelelő alakjuk, méretük és sűrűségük alapján. A szedimentációs sebességét (17) az alábbi egyenlet adja meg:

ahol ρ és ρl a részecske, illetve a folyadék sűrűsége, µ a folyadék viszkozitása, R a részecske effektív sugara, g pedig a gravitáció/centrifugálás miatti gyorsulás. Az E. coli pálcika alakú, 2 mikron hosszú és 0,5 mikron átmérőjű baktériumok (18). Ezért modellezhetjük őket prolate szferoidokként, amelyek effektív ülepedési sugara (R) a következővel adódik (19):

ahol a, és b a fő- és melléktengely félhosszúsága. E. coli esetében tehát a = 1 mikron, és b = 0,25 mikron. Ezen értékek alapján az E. coli esetében 26,7 mikron/másodperc szedimentációs sebességet várunk a felső folyadékon keresztül, és 6,56 mikron/másodperc sebességet a Histopaque 1083.

Az emberi vörösvértestek viszont 7-8 mikron átmérőjű és 2 mikron vastagságú bikonkáv korongok (20). Ennélfogva modellezhetők oblate szferoidokként, amelyek effektív szedimentációs sugara a következővel adódik (19):

ahol a és b a nagy- és kistengely hosszának fele. Az a 4 mikronos és a b 1 mikronos értékeivel azt jósoljuk, hogy ha a műszerünkkel, egy Eppendorf-5804-es készülékkel 400×g relatív centrifugális erővel centrifugálásnak vetjük alá, az RBC-k 500 mikron/másodperc sebességgel fognak ülepedni a ∼1 sűrűségű felső rétegen keresztül.02 g/mL (az általunk mért értékek szerint), és 101 mikron/másodperc sebességgel a Histopaque-on (sűrűség = 1,083 g/mL) keresztül.

A részecskék ülepedési sebessége pontosabban megjósolható a részecske-részecske kölcsönhatások figyelembevételével. Ezek a részecske-részecske kölcsönhatások akkor keletkeznek, amikor egy ülepedő részecske által felfelé kiszorított folyadék közvetlenül az első részecske mögött vagy mellett lévő más részecskékkel ütközik, az utóbbiakat fokozott folyadékellenállásnak kitéve, és ezáltal csökkentve a részecskék mint csoport hatékony (átlagos) ülepedési sebességét. Ezt a jelenséget “akadályozott ülepedésnek” nevezik, és figyelembe kell venni, ha a részecskék térfogattöredéke nem elhanyagolható. Számos félanalitikus vagy empirikus kifejezés áll rendelkezésre az effektív ülepedési sebességek kiszámítására az akadályozott ülepedéssel rendelkező rendszerek esetében (21). Az egyik ilyen megközelítés a Richardson-Zaki korreláció, ahol az effektív ülepedési sebesség (v′) a következővel adódik:

ahol v a részecske ülepedési sebessége akadálymentes esetben, φ pedig a részecskék térfogattömege. A vért általában 1:4 arányú hígításban hígítják vértenyésztő levesbe (22). Mivel a hematokrit (a vörösvértestek térfogattöredéke a vérben) jellemzően 0,4-0,45 körül van (23), az így kapott vörösvértestek térfogattöredéke a mintánkban 0,1 körül van. Ha ezt a 12. egyenlet segítségével figyelembe vesszük, akkor az 1. és 2. közegben lévő RBC-k előre jelzett ülepedési sebessége 307 mikron/másodperc, illetve 62 mikron/másodperc. Továbbá, amikor a vértenyészetek pozitívvá válnak, ∼108 CFU (kolóniaképző egység) (sejteket) baktériumot tartalmaznak ml szuszpenzióban (24). Kis méretük (sugaruk ∼1 mikron) miatt azonban térfogatfrakciójuk 0,001 alatt marad, és az “akadályozott ülepedés” hatása elhanyagolható.

A kiegészítő anyagokban található folyamatábra (1. kiegészítő ábra) egy olyan mintatérfogat esetén, amelyből a kívánt sejttípus(ok)at szeretnénk izolálni, használható az ülepítő puffer kiválasztásához, az adott pufferben a kívánt sejtek ülepedési sebességének előrejelzéséhez, a megfelelő térfogat (oszlophossz a rendelkezésre álló centrifugálócsőben) meghatározásához, és végül a centrifugálás optimális időtartamának (működési ablak) kiszámításához a rendelkezésre álló centrifuga(k) segítségével. A mi rendszerünk esetében (5 ml “pozitív” vértenyésztési táptalaj 15 ml-es centrifugacsövekbe töltve) a folyamatot az 1. táblázat foglalja össze.

1. táblázat. A minimális oszlophosszra és a minimális/maximális üzemidőre vonatkozó elméleti előrejelzések.

Kísérleti validálás

Először szintetikus “pozitív vértenyésztő táptalajt” készítettünk úgy, hogy 8 ml BACTEC Ped-Plus táptalajba (Becton Dickinson, Sparks, MD) 2 ml friss (önkéntesből vett) vért és 0.1ml ∼104 CFU (sejtek) per ml E. coli K-12-t tartalmazó szuszpenziót, és a keveréket 37°C-on egy éjszakán át (12-14 óra) diétás keverőn inkubáljuk, hogy ∼109 RBCs/mL és 108 CFU/mL baktériumot tartalmazó szuszpenziót kapjunk. A levesből 1,5 ml-t vettünk egy mikrocentrifugacsőbe (Eppendorf, New York, USA), és a sejteket centrifugálással “pellettáltuk” ki. A felülúszót kivettük, és az 1 ml tömegét egy mérleg (OHaus® GA-110) segítségével megmértük, hogy megbecsüljük a levesben lévő folyadék sűrűségét.

Kiegészítésképpen 5 ml pozitív vértenyésztő levest 5 ml Histopaque-1083 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USA) tetejére töltöttünk. Több ilyen csövet töltöttünk egy Eppendorf-5804 asztali centrifugába, és különböző ideig centrifugáltuk (1 perc, 3 perc, 6 perc, 10 perc, 15 perc, 30 perc, 50 perc, 70 perc és 90 perc). A centrifugálási folyamat végén a csövet óvatosan eltávolítottuk, a felső réteget (vértenyésztő levest) eldobtuk, míg a Histopaque réteget az alján lévő üledék (ha van) megzavarása nélkül gyűjtöttük össze. A baktériumok koncentrációját a begyűjtött folyadékban standard módszerekkel határoztuk meg, beleértve a sorozatos hígítást, a Tryptic Soy Agarra történő ültetést, az inkubációt és a kolóniaszámlálást (25). A vörösvértestek koncentrációját a minta egy aliquotjának hemocitométerben, mikroszkóp alatt történő vizsgálatával kaptuk meg (26).

Eredmények és megbeszélés

Az eredményeket a 3. ábra foglalja össze. A vonalak az elméleti előrejelzéseink alapján a Histopaque rétegben (mínusz az alján lévő üledék) várhatóan jelenlévő vérsejtek vagy baktériumok elméleti számát jelölik. A tömör szimbólumok a vörösvérsejtek (négyzetek) és az E. coli (rombuszok) megfigyelt számának legalább három mérés átlagát jelentik. A hibasávok a szórást jelölik.

Amint a 3. ábrán látható, a megfigyelt viselkedés minőségileg megfelel az előrejelzéseinknek; mindkét sűrű részecske (RBC-k és baktériumok) esetében a Histopaque-ban lévő koncentrációk kezdetben emelkednek az idővel, majd egy bizonyos ideig állandóak maradnak, végül csökkennek. Azt találtuk azonban, hogy az RBC-k esetében a teljes folyamat (emelkedés, állandósult állapot és csökkenés) az előrejelzettnél valamivel lassabban zajlik. Ennek a kissé alacsonyabb ülepedési sebességnek a hatása szerencsére nem befolyásolja a működési ablakunkat, mivel az ablak kezdetét az az idő határozza meg, amely ahhoz szükséges, hogy az összes baktérium belépjen a sűrű pufferbe. Mire ez bekövetkezik, az RBC-k koncentrációja a sűrű pufferben már elhanyagolható. Más szóval, a modelljeink által megjósolt működési ablak (∼20 perc és ∼75 perc között) érvényesnek bizonyul.

A leggyakrabban előforduló baktériumok is meglehetősen kicsik (∼1 mikron jellemző hosszúságúak), és sűrűségük is hasonló. (pl. 1,1 g/ml a Pseudomonas (27); 1,13 g/ml a Streptococcus (28) és 1,135 g/ml a Bacillus (29) esetében). Így valószínűleg az E. colihoz hasonló szedimentációs sebességgel rendelkeznek mind a vértenyésztési táptalajban, mind a Histopaque-1083-ban, és következésképpen a működési ablaknak is hasonlónak kell lennie. Bár a mi működési ablakunk (∼20 perc és ∼75 perc között) csak a mi hardverünkre és kísérleti paramétereinkre alkalmazható, elméleti elemzésünk alapot nyújt más működési ablakok előrejelzésére, nem csak a baktériumok pozitív vértenyésztő levesekből történő izolálására különböző hardverek használatával, hanem más célsejtek különböző mátrixokból történő izolálására is sűrű pufferek használatával. Ez a módszer szekvenciális módon is alkalmazható egy célsejt izolálására olyan keverékből, amely gyorsabban és lassabban ülepedő fajokat is tartalmaz. Ilyen esetekben a módszerünket először az összes gyorsabban mozgó faj eltávolítására használnánk, majd ezt követően a maradék keverékben lévő leggyorsabban ülepedő célfaj összegyűjtésére.

.