Klonogén vizsgálat: mi, miért és hogyan

A klonogén vizsgálat, más néven kolóniaképződési vizsgálat

egy in vitro sejttúlélési vizsgálat. Az egyes sejtek túlélési és szaporodási képességét értékeli, hogy kolóniákat képezzenek.1 Ezt a próbát először az 1950-es években írták le, ahol a sugárzás rákos sejtek túlélésére és növekedésére gyakorolt hatásának vizsgálatára használták, és később alapvető szerepet játszott a sugárbiológiában.2

A klonogenitás méréséhez a sejteket nagyon alacsony sűrűségben kell elültetni, és 1-3 hétig kell hagyni, hogy kolóniák alakuljanak ki. A kolóniákat ezután rögzítik, kristályviolettel megfestik, hogy láthatóvá váljanak, és megszámolják őket. Az adatok elemzéséhez sejttúlélési görbéket rajzolunk. Napjainkban a klonogén vizsgálatokat számos kísérleti kérdés megválaszolására használják, különösen a rákbiológiában.

Ez a blog kiemeli:

Hogyan kell elvégezni egy klonogén próbát, és milyen fontos szempontokat kell figyelembe venni az eljárás során

A jelölésmentes mikroszkópia és a konfluencia kimutatása a kolóniák számának és méretének értékelésére automatizált képi számszerűsítéssel

A klonogén túlélési próba

A klonogén próbákat széles körben használják a rákkutatás területén, mivel a klónok képződését a tumorindító képességgel rendelkező rákos sejtek tulajdonságaként értelmezik. Bár ezt a próbát eredetileg a sugárbiológia területén használták, mára a rákkutatásban standard eszközzé vált a sejtnövekedés, valamint a különböző, potenciális klinikai alkalmazású szerek citotoxikus vagy genotoxikus hatásainak értékelésére. Ez magában foglalja a kemoterápiás szereket és a célzott terápiákat önmagukban vagy kombinációban 3.

A klonogén növekedést bizonyos sejtpopulációk ősállapotának értékelésére is használják, mivel az őssejtek olyan hosszú életű sejtek, amelyek képesek a folyamatos proliferációra. Ez különösen fontos a rákkutatásban, mivel a rákos őssejteket gyakran összefüggésbe hozzák a kemorezisztenciával, a másodlagos daganatok kialakulásával és a rák kiújulásával. Ezért a rákos őssejtek klonogén próbával történő vizsgálata értékes és széles körben használt eszköz egy adott terápia hatékonyságának előrejelzésére.4

A klonogén próbák a sejtek azon képességét mérik, hogy hosszabb időn keresztül meg tudják-e őrizni szaporodási integritásukat. Ez fontos tulajdonság, mivel olyan fenotípusos hatásokat tár fel, amelyek kialakulásához időre és esetleg több sejtosztódásra van szükség. A terápiás rezisztencia elemzésekor ez különösen fontos. A gyógyszerrezisztencia nem azonosítható rövid távú citotoxicitási vizsgálatokkal5.

Hogyan kell elvégezni a klonogén vizsgálatot

Az ebben a szakaszban szereplő információkat Franken és munkatársai (2006) adaptálták, akik egy klonogén vizsgálati protokollt tettek közzé a Nature Protocols1-ben, kombinálva néhány meglátással a saját tapasztalataimból, amelyeket a PhD-m során több mint 60 klonogén vizsgálat elvégzése során szereztem.

Lényegében két különböző módon lehet elvégezni a klonogén vizsgálatot:

(1) A sejteket kis sűrűségben lehet elültetni, majd kezelni, hogy megvizsgáljuk a kezelés hatását a sejtek klonogenitására.

(2) A sejteket egy meghatározott ideig lehet kezelni, majd alacsony sűrűségben, kezelésmentes táptalajban újratelepíteni a sejteket a klonogén képesség vizsgálata céljából.

Ez utóbbit gyakran használják a kezelés utáni terápiás rezisztencia értékelésére. Az 1. ábra az első megközelítést foglalja össze, amely a hagyományos módszer a klonogén vizsgálat elvégzésére. Amint az világossá válik, ez egy időigényes módszer, amely nem nyújt információt a kísérlet előrehaladásáról (csak a végpontról). Az automatizált és nem végpontos alternatív módszereket később tárgyaljuk.

Hagyományos protokoll a klonogén vizsgálatokhoz

Ábra. 1 | Egy hagyományos klonogén protokoll összefoglalása, amelyben a sejteket beültetik, kezelik, majd értékelik a klonogenitást.

A klonogén vizsgálatokat általában 6 lyukú vagy 24 lyukú lemezekben végzik. A sejteket ritkán és egyenletesen kell elhelyezni, hogy izolált kolóniák alakulhassanak ki. Ezért fontos, hogy a klonogén vizsgálat elvégzése előtt optimalizálja a vetési sűrűséget a választott lyukmérethez.

Egy jó kiindulópont, ha az irodalomban megnézzük, hogy végeztek-e klonogén vizsgálatokat az Ön sejtvonalával, majd ezt a vetési sűrűséget és két-három másikat teszteljük. Az optimalizálási folyamat során fontos figyelembe venni a kísérleti végpontot (pl. 7 nap, 14 nap vagy 21 nap) és a sejtnövekedési sebességet is, mivel nem akarja, hogy a kolóniák összeolvadjanak, ami zavarja a kolónia mennyiségi meghatározását és elemzését. A vetési sűrűségnek azonosnak kell lennie a kísérleten belüli valamennyi kezelési körülmény esetében.
A megfelelő kontrollok használata kritikus fontosságú az elemzési szakaszban. Mindig kell használni egy kezeletlen kontrollt, valamint egy csak hordozót tartalmazó kontrollt (ez lehet DMSO, PBS vagy bármilyen oldószer, amelyben a kezelést feloldották). A kezelési körülményekhez gyakran használnak hígítási sorozatot. A kezelés időtartama és a kezelés keménysége segít meghatározni a koncentrációtartományt – ez valószínűleg némi optimalizálást igényel. Minden kontroll- és kísérleti feltételt három példányban kell elvégezni.

A kolóniaképződési fázisban a kolóniák növekedését minden kezelési körülmények között nyomon kell követnie. Egy kolóniának 50 vagy több sejtet tekintünk, és ezek csak mikroszkóp alatt láthatók. Mivel ez a vizsgálat jellemzően hosszú ideig tart, a sejtközegeket cserélni kell. A sejtek kezdetben nagyon alacsony konfluenciájúak lesznek, így nem kell olyan rendszeresen cserélni a tápfolyadékot, mint máskor. Ha azonban vetést végez, majd gyógyszerrel vagy vegyülettel kezeli, fontos, hogy figyelembe vegye annak felezési idejét, és szükség szerint friss kezelést adjon hozzá.

A kutatók számára, akiket érdekel a kolónia növekedésének időbeli leképezése. Javasoljuk, hogy tekintsék meg a CytoSMART Omnit.

—————–

Gyakran a kontroll körülmények között lévő telepek nőnek a leggyorsabban, ezért ezeket a sejteket használhatja a kísérleti végpont jelzéséül, azaz fejezze be a kísérletet, mielőtt a telepek elkezdenek összeolvadni, és ha ez túl gyorsan történik, inkább használjon kisebb vetési sűrűséget a kísérlethez. Fontos, hogy a kísérletet minden kezelési körülmény esetében egyszerre fejezze be.

Amikor elérte a kísérleti végpontot, a sejteket óvatosan át kell mosni PBS-szel (a PBS-t a lyuk oldalához kell adni, hogy ne zavarja meg a telepeket), fixálni kell, és legalább 30 percig a DNS-interkaláló festékkel, kristályviolettel (0,5% w/v) kell festeni. A felesleges festék eltávolítása rendetlen lehet. A legjobb technika, ha a lemezeket óvatosan vízbe mártott főzőpohárba mártjuk, amíg az összes felesleges festéket el nem távolítjuk, és csak élénk lila kolóniák maradnak. A festett telepeket a festés után akár 50 héttel is meg lehet számolni. Készítsen nagy felbontású képeket a kutakról, amelyeket elemzéshez, prezentációkhoz és publikációs ábrákhoz használhat.

A kutatók támogatására a kolóniaképződési próbák elemzésében és optimalizálásában a CytoSMART bevezetett egy alkalmazást a CytoSMART Omni készülékhez, amely a telepek kimutatására alkalmas a teljes kutas lemezek (time-lapse) képein 10X-es nagyítással. Az inkubátorban végzett time-lapse képalkotás a végpont helyett kinetikai információkat szolgáltathat, ami részletesebb információt adhat arról, hogy a kezelés mikor kezd el hatni a sejtekre. A címkézésmentes képelemzés kolóniák kimutatására, méretük és körkörösségük értékelésére szolgál. Pontosítani, hogy mikor kezdenek a telepek összeolvadni, és ennek megfelelően optimalizálni.

Hogyan elemezze a klonogén vizsgálatot

Ez tényleg olyan egyszerű, mint kézzel megszámolni a telepeket minden egyes kezelési feltételhez, és az adatokat túlélési görbeként ábrázolni (legalább három biológiai ismétlést kell használnia a görbéhez).

A túlélési görbéhez a kezelt sejtek túlélő frakcióját (SF) kell kiszámítani (ez magában foglalja a képződött telepek és a beültetett sejtek arányát), és a kezelési dózis függvényében ábrázolni. Az SF kiszámítása előtt meg kell határozni a sejtek lemezképzési hatékonyságát (PE), mivel a különböző sejtvonalak eltérő lemezképzési hatékonysággal rendelkeznek, és ez befolyásolja a túlélési frakció kiszámítását.

A PE a telepek számának és a kezeletlen sejtekbe vetett sejtek számának aránya1. Az 1. ábra mutatja a PE és SF képleteket és egy példát a túlélési görbére.

A telepek kézi számlálása fárasztó és hajlamos lehet a torzításra, ezért számos szabadon hozzáférhető számítógépes képelemző eszközt fejlesztettek ki a klonogén próbák képeinek gyors és objektív elemzésére. Említést érdemel a Brzozowska és munkatársai (2019) által kifejlesztett, szabadon hozzáférhető szoftvercsomag, amely nemcsak megszámolja a telepeket, hanem méreteloszlásukat is ábrázolja, ami a hasznos sejtmagatartási információk egy újabb rétegét jelenti (lásd a 2a. ábrát).6

Az egyes telepek megszámlálásának és számszerűsítésének alternatívája a kút területének a telepek által borított százalékos arányának (kolónia terület százalékos aránya) meghatározása a klonogén sejtnövekedés számszerűsítése céljából. Guzmán és munkatársai (2014) kifejlesztettek egy szabadon elérhető ImageJ plugint, a ColonyArea-t, amely pontosan ezt teszi (lásd a 2b. ábrát).7Ez egy hasznos eszköz, ha olyan összevont kolóniák vannak, amelyeket szemmel vagy kolóniaszámláló szoftverrel nehéz megszámolni, vagy ha egy gyors és nagy áteresztőképességű elemzési módszert szeretnénk.

Ábra. 2 | Szabadon elérhető klonogén assay mérőeszközök. (A) Brzozowska és munkatársai kifejlesztettek egy szoftvert (countPHICS), amely megszámolja a kolóniákat és méri a kolóniák méretét.6 (B) Guzmán és munkatársai kifejlesztettek egy ImageJ plugint, a ColonyArea-t, amely számszerűsíti a kolónia növekedési területét és a festődés intenzitását.7

Jelzésmentes, nem végpontos, félautomatizált klonogén vizsgálati protokoll

Mayr és munkatársai (2018) nemrégiben megjelent tanulmánya egy új és módosított klonogén vizsgálati protokollt ír le, amely 96 lyukú mikrolemez formátumot és konfluencia detektálást használ a telepek mérésére. Ez a módszer átfogó kísérleti beállításokat tesz lehetővé egy 96-lyukú lemez használatával, jelölésmentes, nincs festési végpontja, és az elemzés félautomata (3. ábra)8 . Továbbá az időfelbontású, nem végpontos konfluencia-mérés ugyanabban a kútban azt mutatta, hogy a félautomata elemzés alkalmas a kolóniák számának és átlagos méretének meghatározására.

Figure. 3 | Mayr és munkatársai a klonogén növekedést 96 lyukú formátumban idővel értékelték a konfluencia kimutatásával8. A grafikon a klonogén növekedés számszerűsítését mutatja a különböző időpontokban, a képek pedig a konfluencia-detektálással ellátott specifikus kutakat mutatják. A zöld foltok a konfluencia-olvasóval detektált területeket, a narancssárga nyilak pedig az egyesült kolóniákat jelzik.

Ez a klonogén vizsgálati módszer idő- és költséghatékony alternatívát nyújt a standard klonogén vizsgálati protokollhoz képest. Mivel nincs szükség végpontrögzítésre és festésre, ez a protokoll lehetővé teszi a klonogén növekedés folyamatos nyomon követését és elemzését. Továbbá a kísérlet során a kolóniák növekedésének kinetikájára vonatkozó további mérőszámok is kinyerhetők. A miniatürizált formátum lehetőséget teremt olyan drága kezelések, például siRNS-alapú vagy CRISPR/Cas9-alapú terápiák tesztelésére is, amelyek egy 6 lyukú vagy 24 lyukú lemezhez szükséges kezelési mennyiséggel nem lennének megvalósíthatók. Végső soron Mayr és munkatársai bebizonyították, hogy a konfluencia detektálással végzett jelölésmentes mikroszkópia robusztus és életképes lehetőség a klonogenitás mérésére.

Egy jelölésmentes, nem végpontos és automatizált megoldás a klonogén vizsgálatokhoz a CytoSMART Omni a kolónia detektálási algoritmusával. A kolóniaképződés idővel mérhető egy teljes üregben a kolóniák számának, méretének és körkörösségének leolvasásával. A sejteknek nem kell elhagyniuk az inkubátort, és a sejtkinetikai információk a kolóniaképződés folyamata során nyerhetők (4. ábra).

4. ábra | Automatizált kolónia kimutatás a CytoSMART Omni segítségével. A 24 lyukú lemezben lévő HEP-G2 májráksejteket 75 órán keresztül képezték le a CytoSMART Omni segítségével, amelyet egy standard CO2 inkubátorban tartanak. A képen egy teli kút látható a kolóniadetektáló algoritmus futtatása után, a narancssárga kolóniamaszkkal kiemelt sejtklaszterekkel. A kolóniák számát, méretét és körkörösségét a vizsgálat időtartama alatt mértük, és a grafikonokon látható.

Tudjon meg mindent a CytoSMART képalkotó megoldásokról itt

.