Mechanisms of resistance to fluoroquinolones and carbapenems in Pseudomonas putida

Abstract

Objectives: A Pseudomonas putida egy ritka opportunista kórokozó, amely általában érzékeny az antimikrobiális szerekre. A klinikai P. putida izolátumok antimikrobiális szerekkel szembeni rezisztenciájára vonatkozó adatok korlátozottak.

Páciensek és módszerek: A fluorokinolonokkal, karbapenemekkel és más antibiotikumokkal szembeni érzékenységet jellemeztük a P. putida öt klinikai izolátumában, amelyeket különböző, húgyúti fertőzésben szenvedő betegekből mint kórokozókból nyertünk. A fluorokinolon- és karbapenem-rezisztenciát genetikailag jellemezték a PCR és a DNS-szekvenálás módszerével. A külső membránfehérje (OMP) profilokat SDS-PAGE segítségével jellemeztük.

Eredmények: Öt izolátumból négy volt rezisztens vagy intermedier rezisztens mind a fluorokinolonokkal, mind a karbapenemekkel szemben. A kinolonrezisztenciát meghatározó régiók nukleotidszekvenciái arra utaltak, hogy az olyan aminosavmutációk, mint a Thr-83→Ile a GyrA-ban és a Glu-469→Asp a GyrB-ben hozzájárulhatnak a fluorokinolonokkal szembeni magas rezisztenciához. Négy metallo-β-laktamáz-termelő izolátum, amely karbapenemekkel szembeni rezisztenciát mutatott, IMP-típusú metallo-β-laktamáz gént hordozott. A 46 kDa OMP és a metallo-β-laktamáz termelés csökkent termelésének együttes hatását mutatta ki a karbapenemek legmagasabb MIC-értékeit mutató P. putida izolátum.

Következtetések: Ez a vizsgálat a fluorokinolonokkal és karbapenemekkel szembeni rezisztencia mechanizmusait azonosította a klinikai P. putida izolátumokban.

Bevezetés

A Pseudomonas putida, egy nem fermentáló Gram-negatív bacilus, opportunista humán patogén, amely újszülöttkori, neutropeniás és daganatos betegek bakteriémiájáért és szepsziséért, valamint húgyúti fertőzésekért (UTI) felelős.1-4 Bár nem gyakori, a P. putida veszélyeztetett gazdáknál nosokomiális fertőzéseket okozhat.3

A legtöbb P. putida érzékeny az olyan antimikrobiális szerekre, mint a karbapenemek, fluorokinolonok és aminoglikozidok.5-7 Azonban olyan klinikai P. putida izolátumokról is beszámoltak, amelyek metallo-β-laktamázokat termelnek, amelyek rezisztenciát biztosítanak a β-laktámokkal, köztük a karbapenemekkel szemben.3,4,8,9. A közelmúltban beszámoltak továbbá olyan metallo-β-laktamáz-termelő izolátumokról, amelyek a β-laktámok mellett ciprofloxacinnal, gentamicinnel és tobramicinnel szemben is rezisztenciát mutattak3. A többszörösen rezisztens P. putida megjelenése nehézséget okoz a fertőzések kezelésében, és a nosocomiális átvitel kockázatát jelenti.

Néhány korábbi tanulmányban a P. putida antibiotikum-rezisztenciáját a metallo-β-laktamázok termelése és az effluxrendszerek jellemzői alapján jellemezték.3,4,8-12 Az európai, koreai és japán jelentések szerint a karbapenem-rezisztens P. putida gyakran termel IMP- és VIM-típusú metallo-β-laktamázokat.3,4,8,9,9a Az olyan effluxrendszerek, mint a TtgABC, MepABC, TtgDEF és ArpABC szintén hozzájárulhatnak a P. putida többszörös gyógyszerrezisztenciájához.10-12 A Pseudomonas aeruginosa képes a kezelés során gyorsan rezisztenssé válni,13 bár nem világos, hogy a P. putida is rendelkezik-e ezzel a potenciállal. Az antibiotikum-rezisztencia kialakulásának kockázatának felméréséhez bőséges adatokra van szükség a klinikai P. putida izolátumok antimikrobiális szerekkel szembeni rezisztenciájára vonatkozóan. Ebben a tanulmányban meghatároztuk az antimikrobiális szerekkel, köztük fluorokinolonokkal és karbapenemekkel szembeni érzékenységeket, és jellemeztük a fluorokinolonokkal és karbapenemekkel szembeni rezisztencia mechanizmusait a klinikai P. putida izolátumokban, amelyeket kórházunkban egy év alatt UTI-ket okozó kórokozóként nyertünk.

Betegek és módszerek

Betegek

Öt beteg (négy férfi és egy nő), akiket akut, ismétlődő vagy krónikus P. putida által a Hamamatsu Egyetemi Kórházban 2001 októbere és 2002 szeptembere között okozott P. putida okozta UTI-t.

Baktériumtörzsek és mikrobiológiai módszerek

A vizsgálatban használt törzsek a P. putida öt klinikai izolátumai voltak, amelyeket különböző betegekből nyertek ki kórokozóként. Az azonosítás standard biokémiai vizsgálatokkal történt klinikai mikrobiológiai laboratóriumunkban. Valamennyi izolátumot vizeletből nyerték. Az öt izolátum kromoszómális DNS-ének SpeI-korlátozott töredékmintái eltérőek voltak (1. ábra). A baktériumokat -70°C-on tároltuk 20% glicerint tartalmazó szívinfúziós tápoldatban (Nissui Pharmaceutical, Tokió, Japán). Ezt követően a baktériumokat szívinfúziós agarlemezekre (Nissui Pharmaceutical) oltottuk és 37°C-on inkubáltuk egy éjszakán át. A MIC-értékeket a Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), korábban National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) által leírt agar-hígítási módszerrel határoztuk meg.14 A fogékonysági vizsgálatot Mueller-Hinton agar (Nippon Becton Dickinson, Tokió, Japán) segítségével végeztük a gyártó utasításainak megfelelően. A ceftazidim, imipenem, meropenem, norfloxacin, levofloxacin, gatifloxacin, gentamicin, amikacin és minociklin MIC-értelmezési kritériumai a CLSI/NCCLS kritériumait követték.14 A többi antimikrobiális szer MIC töréspontjait nem határozták meg.

Antimikrobiális szerek

A kinolonrezisztenciát meghatározó régiók amplifikálása és DNS-szekvenálása

A kromoszómális DNS-t a P. putida izolátumokból a korábban leírtak szerint extraháltuk.15 A PCR-amplifikációt specifikus primer-készletekkel végeztük. Az 5′-gacggcctgaagccgccggtgcac-3′ és 5′-gcccacacggcgcgataccgctgga-3′ primerkészlet a gyrA gén kinolonrezisztenciát meghatározó régióinak (QRDR) 417 bp hosszúságú fragmentumát amplifikálta a 115 és 531 közötti pozícióktól.16 Az 5′-agtacttcgccgccgacttcct-3′ és 5′-tacaggcgcgcgacaggcgcgctt-3′ primer készlet a gyrB gén QRDR-jének 739 bp hosszúságú fragmentumát amplifikálta az 1073 és 1811 közötti pozícióktól.17 Az 5′-tctacggccatgagcgaactgg-3′ és 5′-agcagcacctcggaatagcg-3′ primer készlet a parC gén QRDR-jének 262 bp hosszúságú fragmentumát amplifikálta a 158 és 419 pozíció között.18 Az amplifikációkat Advantage-GC2 enzimmel (BD Biosciences Clontech Japan, Tokió, Japán) végeztük a gyártó utasításai szerint. A QRDR-ek szekvenálását BigDye terminator v3.0 Taq cycle sequencing ready reaction kit és AmpliTaq DNS-polimeráz (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) és egy automatizált DNS-szekvenáló rendszer (ABI PRISM 310 genetikai analizátor, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) segítségével végeztük.

A metallo-β-laktamáz gének genetikai kimutatása

A külső membránfehérjék előállítása

A külső membránfehérjéket (OMP) a korábban leírtak szerint állítottuk elő.21 A mintákat SDS-PAGE segítségével elemeztük.

Eredmények

Az érzékenység

A fluorokinolonok és karbapenemek érzékenységi vizsgálatának eredményeit az 1. és 2. táblázat foglalja össze. A β-laktámok MIC-értékei az ampicillin és a cefaloridin esetében >128 mg/l, a ceftazidim esetében 2 és >128 mg/l, az imipenem esetében 1 és 128 mg/l, a panipenem esetében 0,5 és >128 mg/l, a meropenem esetében 4 és >128 mg/l, a biapenem esetében pedig 1 és >128 mg/l között mozogtak. Az aminoglikozidok és a minociklin MIC-tartományai a következők voltak: 0,25-8 mg/l a gentamicin esetében, 0,5-8 mg/l az amikacin esetében, 0,5-1 mg/l a kanamicin esetében és 4-64 mg/l a minociklin esetében. Négy izolátum fluorokinolonokkal és karbapenemekkel szemben egyaránt rezisztens vagy intermedier, míg egy izolátum, a HU2001-429 mind a β-laktámokkal, mind a fluorokinolonokkal szemben érzékeny volt. Három P. putida izolátum, a HU2001-412, HU2001-419 és HU2001-451 rezisztenciát mutatott az összes vizsgált β-laktámmal, így a ceftazidimmel, imipenemmel és meropenemmel szemben. Három izolátum, a HU2001-412, HU2001-419 és HU2002-467 magas fluorokinolon-rezisztenciát mutatott (>128 mg/l), beleértve a norfloxacint, levofloxacint, sparfloxacint, gatifloxacint és pazufloxacint, valamint minociklin-rezisztenciát (32-64 mg/l). Az öt izolátum esetében a szitafloxacin MIC-tartománya ≤0,125 és 8 mg/L között volt.

Fluorokinolon-rezisztencia

Karbapenem-rezisztencia

Az öt P. putida izolátum közül négy, karbapenem-rezisztenciát mutató egyed IMP-típusú metallo-β-laktamáz gént hordozott, míg a VIM-típusú metallo-β-laktamáz gént nem mutatta ki a PCR (2. táblázat). A karbapenemek MIC-tartományai az IMP-típusú metallo-β-laktamáz gént hordozó P. putida esetében a következők voltak: 8 és 128 mg/l között az imipenem esetében, 32 és >128 mg/l között a panipenem esetében, 128 mg/l vagy annál nagyobb a meropenem esetében és 32 és >128 mg/l között a biapenem esetében. A P. putida HU2001-451-ben, amely az öt izolátum közül a karbapenemek legmagasabb MIC-értékét mutatta, a 46 kDa OMP termelése SDS-PAGE segítségével nem volt kimutatható, míg a P. putida HU2001-412, HU2001-419, HU2001-429 és HU2002-467 esetében hasonlóan volt kimutatható (2. táblázat).

Diszkusszió

Ebben a vizsgálatban a P. putida öt klinikai izolátumának fluorokinolonokkal és karbapenemekkel szembeni érzékenységét jellemeztük, amelyeket különböző, akut, ismételt vagy krónikus húgyúti fertőzésben szenvedő betegekből izoláltunk. Mind az öt izolátum különböző PFGE genotípust mutatott, ami arra utalt, hogy az e P. putida által okozott fertőzések egyike sem volt nosocomiális. Az öt izolátumból négy fluorokinolonokkal és karbapenemekkel szemben egyaránt rezisztens vagy intermedier rezisztens volt. Három izolátum magas rezisztenciát mutatott (>128 mg/L) minden vizsgált fluorokinolonra, kivéve a szitafloxacint. Az ebben a vizsgálatban vizsgált fluorokinolonok közül a szitafloxacin jobb hatékonyságot mutatott a P. putida izolátumokkal szemben. Ezek a fluorokinolonokkal szemben erősen rezisztens izolátumok a karbapenemekkel és a minociklinnel szemben is rezisztensek voltak. Minden izolátum érzékeny volt az aminoglikozidokra, például az amikacinra.

A P. putida fluorokinolon-rezisztenciájával kapcsolatos vizsgálatok korlátozottak.6,12 A P. aeruginosa esetében a fluorokinolon-rezisztenciáért felelős főbb mechanizmusok közé tartoznak a DNS-giráz vagy a topoizomeráz IV aminosavmutációi, amelyeket a GyrA és a ParC QRDR-ek mutációi okoznak, míg egyes jelentések a GyrB mutációinak részvételét feltételezik a fluorokinolon-rezisztenciában.18,22 A P. aeruginosa egy másodlagos rezisztencia mechanizmusa, amely az efflux rendszereket érinti, hozzájárul a fluorokinolonokkal szembeni csökkent érzékenységhez.22,23 Ebben a vizsgálatban a GyrA, GyrB és ParC QRDR-jeiben található aminosavváltozásokat hasonlítottuk össze a P. putida öt klinikai izolátumában. A fluorokinolon-rezisztens P. putida további mutációkat mutatott, mint például Thr-83→Ile a GyrA-ban és Glu-469→Asp a GyrB-ben, amelyek megegyeztek a fluorokinolon-rezisztens P. aeruginosa-ban talált mutációkkal.22,23 Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a QRDR-ekben található aminosavmutációk, mint például a Thr-83→Ile a GyrA-ban és a Glu-469→Asp a GyrB-ben, hozzájárulhatnak a fluorokinolonokkal szembeni magas rezisztenciához, bár nem határozták meg, hogy a vad típusú gyrA, gyrB vagy parC géneket hordozó plazmidokkal történő transzformáció az ilyen izolátumokba csökkenti-e a fluorokinolonok MIC értékeit.24 A szitafloxacin MIC tartománya ≤0,125 és 8 mg/L között volt az öt P. putida izolátum esetében. Bár korábbi jelentések szerint a TtgABC, MepABC, TtgDEF és ArpABC effluxrendszerek túlterjedése is hozzájárulhat a P. putida többszörös gyógyszerrezisztenciájához,10,11,12 az effluxrendszerek szerepe ebben a vizsgálatban tisztázatlan maradt.

A P. putida metallo-β-laktamázok termelése által okozott karbapenemrezisztenciáról már beszámoltak.3,4,8,9,9,9a Ezek a P. putida-ban talált metallo-β-laktamázok IMP- és VIM-típusúak voltak.3,4,8,9,9,9a A négy karbapenem-rezisztens P. putida-ban a metallo-β-laktamázok termelését korongdiffúziós módszerrel mutatták ki (adat nem látható). Ezek az izolátumok az IMP-típusú metallo-β-laktamáz géneket hordozták, míg a VIM-típusú metallo-β-laktamáz géneket nem mutatták ki PCR segítségével. A metallo-β-laktamáz-termelő P. putida prevalenciája fontos klinikai probléma, amely a β-laktámrezisztencia genetikai meghatározóinak rezervoárját jelenti. A P. aeruginosa esetében a karbapenem-rezisztencia egyéb fő mechanizmusai közé tartozik az OprD – a karbapenemek, de más β-laktámok számára nem hozzáférhető pórusképző transzmembrán csatorna – elvesztéséből eredő mutációs átjárhatatlanság, valamint a metallo-β-laktamázok termelése21,25,26 . Az OprD elvesztése imipenemmel szembeni rezisztenciát és meropenemmel szembeni csökkent érzékenységet eredményez a P. aeruginosa-ban.27 A P. putida HU2001-451 esetében, amely a négy karbapenem-rezisztens izolátum közül az összes karbapenem közül a legmagasabb MIC-értéket (≥128 mg/l) mutatta, a 46 kDa OMP termelése csökkent a többi izolátuméhoz képest. A P. putida HU2001-451 OMP-profilja hasonló volt a karbapenem-rezisztens P. aeruginosa profiljához, amelyben korábbi vizsgálatunkban az OprD csökkent termelődését azonosítottuk.21 Ezek az eredmények a 46 kDa OMP csökkent termelésének és a metallo-β-laktamázok termelésének együttes hatását mutatták az izolátum karbapenem-rezisztenciájára, bár nem világos, hogy más β-laktamázoknak van-e jelentősége a karbapenem-rezisztencia szempontjából.

Összefoglalva, jellemeztük a P. putida klinikai izolátumaiban a fluorokinolon- és karbapenem-rezisztenciát. Eredményeink arra utalnak, hogy a QRDR-ek aminosavmutációi, mint például a Thr-83→Ile a GyrA-ban és a Glu-469→Asp a GyrB-ben, hozzájárulhatnak a P. putida fluorokinolonokkal szembeni magas rezisztenciájához. Négy metallo-β-laktamáz-termelő P. putida izolátum, amely rezisztenciát mutatott karbapenemekkel szemben, IMP-típusú metallo-β-laktamáz gént hordozott. A 46 kDa OMP csökkent termelésének és a metallo-β-laktamázok termelésének együttes hatását találtuk, amely fokozta a karbapenem-rezisztenciát a P. putida egyik olyan izolátumában, amely a legmagasabb MIC-értékeket mutatta a karbapenemekkel szemben.

Köszönjük a Miroku Medical Laboratory, Saku, Nagano, Japán, PFGE-analízisét. T. H.-t a japán Oktatási, Kulturális, Sport, Tudományos és Technológiai Minisztérium által nyújtott tudományos kutatási támogatás (17790353) támogatja.