Real-time imaging of single-molecule co-IP
Először is megmutatjuk, hogy egy fehérje-fehérje kölcsönhatás kinetikája mérhető sejtkivonatokban single-molecule szinten (1. ábra). Egy sejtszignálútvonal modellkölcsönhatásaként a Ras és a Raf közötti kölcsönhatást választottuk, amely a konzervált MAPK-útvonal kezdeti lépése, amely számos humán rákos megbetegedésben hiperaktivált5,6,7 . A cRaf Ras-kötő doménjét (cRafRBD) és a HRas egy olyan változatát használtuk, amely egy egypontos mutációt, Q61L-t tartalmaz, amely konstitutívan aktívvá teszi6,8,9,10,11,12 . A két fehérjét koexprimáló HeLa sejtek élő sejtes képalkotása nagyfokú ko-lokalizációt mutatott (1a. ábra és S2. kiegészítő ábra). Ezt a ko-lokalizációt a HRas rapamicin által kiváltott transzlokációjával a plazmamembránba13 tudtuk irányítani, ami a cRafRBD egyidejű lokalizációját eredményezte ugyanezekre a foltokra. A hagyományos co-IP is egyértelmű western sávot eredményezett, ami a konstitutívan aktív HRas és a cRafRBD közötti szelektív fehérje-fehérje kölcsönhatásra utal (1b. ábra, balra). Megállapítottuk azonban, hogy ez a látszólag tiszta fehérjesáv a teljes prédafehérjéknek csak kevesebb mint 5%-át tartalmazta, ami arra utal, hogy a prédafehérjék esetleg nem kötődtek stabilan a csalétekhez, hanem a mosási folyamatok révén az átfolyó részbe kerültek (1b. ábra, jobbra és S3. kiegészítő ábra). Megjegyezzük továbbá, hogy mind az élősejtes képalkotás, mind a co-IP megközelítés nem képes feltárni ennek a talán gyenge, átmeneti fehérje-fehérje kölcsönhatásnak a valódi kinetikáját.
(a) A HRas-cRafRBD kölcsönhatás élősejtes ko-lokalizációs vizsgálata. A HRas és a cRafRBD közötti fehérje-fehérje kölcsönhatásokat a cRafRBD plazmamembránba történő transzlokációjának megfigyelésével vizsgáltuk a HRas-szal együtt. A CA és a DN a HRas konstitutívan aktív, illetve domináns negatív formáját jelöli. Méretsáv: 10 μm. (b) Hagyományos co-IP adatok a HRas-cRafRBD kölcsönhatásról. A co-IP elemzésekhez GST-cRafRBD (balra), illetve mCherry-HRas fehérjéket (jobbra) használtunk gyöngyökre immobilizált csaliként. (c) A valós idejű egymolekulás co-IP vázlata. (d) TIRF-kép az immobilizált mCherry-HRas felületén. Méretsáv, 10 μm. (e) Egymást követő képkockák az egymolekulás co-IP valós idejű képalkotásáról. A kötési események valós idejű nyomvonala f-ben látható, piros négyzettel jelölve. Méretsáv, 1 μm. (f,g) Példaértékű valós idejű nyomvonalak a valós idejű egymolekulás co-IP képalkotásból. A jel főként diffúz háttér-fluoreszcenciából áll, amelyet fluoreszcens tüskék sorozata szuperponál. (h) Negatív kontrollkísérlet felületen immobilizált DN HRas (S17N) segítségével. (i) A kbind eloszlása az f. pontban szereplő kísérlethez. A releváns kinetikai sebességeket egyszeres exponenciális görbeillesztéssel határoztuk meg (folytonos vonalak). (j) Egy második negatív kontrollkísérlet felület-immobilizált FLAG-eGFP-vel. (k) A kdiss eloszlása az f. kísérlethez és a kblinking eloszlása a j. kísérlethez. A releváns kinetikai sebességeket egy exponenciális görbe illesztésével határoztuk meg (folytonos vonalak). A hibasávok a standard hibát (s.e.; n>200) jelölik.
A HRas-cRafRBD kölcsönhatás valós idejű, egymolekulás szintű vizualizálásához a HRas gént az mCherry vörös fluoreszcens fehérjével, a cRafRBD-t pedig az eGFP-vel (enhanced green fluorescent protein; 1c ábra) fuzionáltuk. Mindkét fehérjét HEK293 sejtek külön csoportjában fejeztük ki. Az mCherry-HRas felszínen történő immobilizálásához az egymolekulás pull-down stratégiát alkalmaztuk2,3 (1c. ábra). Ezután az eGFP-cRafRBD-t tartalmazó második teljes sejt lizátumot az mCherry-HRas immobilizált felületre injektáltuk, mint a hagyományos co-IP során (1c. ábra). Teljes belső visszaverődéses (TIR) mikroszkópot használtunk, hogy evaneszcens elektromos mezőt hozzunk létre, amely szelektíven gerjesztette a felület 100 nm-en belülre került eGFP-cRafRBD-ket. A gyenge fehérje-fehérje kölcsönhatások megfigyelése érdekében a felületre érkező egyes eGFP-cRafRBD-ket valós időben követtük nyomon a kamrában tartott második teljes sejt lizátummal (1c. ábra).
Az 1f. ábra ennek az egymolekulás co-IP preparátumnak egy tipikus valós idejű nyomvonalát mutatja. Minden egyes nyomvonal a fluoreszcenciajel integrálásával készült egy 1,1 μm2 területű kör alakú érdeklődési terület (ROI) felett (1e. ábra). Az mCherry-HRas felületi sűrűségét úgy szabályoztuk, hogy átlagosan 0,5 HRas molekula legyen ROI-nként (S4 kiegészítő ábra). Gauss-szűrést alkalmaztunk a jelintegráció során, és szigorú küszöbértéket alkalmaztunk a jeldetektáláshoz, hogy biztosítsuk, hogy a valós idejű nyomvonalak egyetlen HRas fehérje kötődési eseményeit jelentik (1g. ábra és Kiegészítő ábra S5). Minden valós idejű nyomvonal egyértelműen két részből áll: a háttér-fluoreszcenciából és az egyes fluoreszcens tüskékből. Az egyes eGFP-cRafRBD molekuláknak, amelyek a Brown-mozgás szerint mozognak, kevesebb mint 50 μs-t kell eltölteniük egy-egy látogatással a TIR gerjesztőrétegben. Mivel 50 μs három nagyságrenddel rövidebb, mint a képalkotó készülékünk időfelbontása (50 ms), a sok eGFP-cRafRBD molekula Brown-mozgása állandó szintű háttérfluoreszcenciát eredményez. Az egyes fluoreszcencia-csúcsok ezzel szemben azt jelzik, hogy egyetlen eGFP-cRafRBD elég hosszú ideig lépett kölcsönhatásba egy molekulával a felszínen ahhoz, hogy túlélje az 50 ms-os jelintegrációt.
A következőkben ennek a fehérje-fehérje kölcsönhatásnak a lényeges kinetikáját elemeztük a τoff, a kötési események közötti idő, és a τon, az egyetlen kötési esemény időtartama elemzésével (1g. ábra). A τoff és τon eloszlásokra egyetlen exponenciális egyenletet illesztve megkaptuk a kbind és kdiss kinetikai sebességét. Annak biztosítására, hogy a fluoreszcencia tüskék valóban egy specifikus HRas-cRafRBD kölcsönhatás eredménye, ugyanazt az eGFP-cRafRBD kötődési kísérletet végeztük el felületimmobilizált domináns negatív HRas-szal (S17N), amelynek a GTP-vel szembeni affinitása csökkent14,15 . A domináns negatív formával a fluoreszcencia tüskefrekvencia (kbind) jelentősen csökkent (1h ábra). Ez a negatív kontroll bizonyítja, hogy a fluoreszcencia tüskék nem az egyszerű eGFP-cRafRBD felületi adszorpcióból eredő artefaktumok, és nem is más fehérjék felületi immobilizációjából adódnak, amelyek hamis eGFP-cRafRBD kölcsönhatásokat okoznak. Ehelyett ezek a fluoreszcens tüskék nyomai hűen jelentik a HRas-cRafRBD kötődési eseményeket.
Az is figyelemre méltó, hogy egy-egy kötődési esemény időtartama jellemzően csak néhány száz ms (1f. ábra). A felületre immobilizált FLAG-eGFP16 villódzási dinamikáját anti-FLAG antitesttel vizsgáltuk (1j. ábra). A FLAG-eGFP fotóvillogása átlagosan néhány másodpercenként történik, ami 0,3 s-1-nél kisebb kinetikai sebességet ad, és ez az eGFP fotóvillogási sebessége egy nagyságrenddel lassabb, mint az általunk mért kdiss (1k. ábra). Ezenkívül a kbind és kdiss összes egymolekulás kinetikai sebességét újraértékeltük egy olyan ko-lokalizációs kritériummal, amely az mCherry-HRas és az eGFP-cRafRBD fehérjék fluoreszcenciajelének ko-lokációját követelte meg (S6. kiegészítő ábra). Így a HRas-cRafRBD kölcsönhatásnak valóban gyors, másodpercenként néhányszoros fluktuációval kell rendelkeznie11,12.
A találkozási komplexek vizualizációja a Ras-Raf kölcsönhatásban
A HRas-cRafRBD kötési gyakoriságának (kbind) részletes elemzése a gyors, kiegyenlítődés előtti találkozási komplexek17,18,19,20,21 létezésére utal, amelyek laza fehérje-fehérje kölcsönhatási intermedierek, amelyeket a végső HRas-cRafRBD komplex kialakulása előtt kell benépesíteni (2. ábra). Amikor az eGFP-cRafRBD koncentrációját 5-ről 50 nM-ra növeltük, a kbind parabolikus növekedést mutatott (2a. ábra), amely a legjobban illeszthető a 
egyenlethez, amelynek Hill-együtthatója (n) 1,1 (22,23), disszociációs állandója (K1) 43 nM a találkozási komplex kialakulásához, κon pedig 2 volt.16 s-1 nM-1, ami a találkozási komplexből a végső kötött állapot kialakulásának kinetikai sebessége (Kiegészítő módszerek és Kiegészítő S7. ábra). kdiss ezzel szemben nagyrészt állandó az általunk vizsgált eGFP-cRafRBD koncentrációk esetében (2b. ábra). Ezek a valós idejű egymolekulás co-IP-vel mért kinetikai sebességek szorosan összhangban vannak a korábbi, ömlesztett biokémiai próbákkal végzett jelentésekkel (Kiegészítő S1 táblázat). Egy megjegyzés, hogy a végső HRas-cRafRBD komplex esetében egy domináns konformációt feltételeztünk. Bár feltételezésünket alátámasztják a fluoreszcencia tüskék intenzitásának unimodális eloszlásai (Kiegészítő ábra S8), nem zárhatjuk ki teljesen annak lehetőségét, hogy a HRas-cRafRBD komplexnek többféle konformációja létezik, többféle útvonallal, amely hozzájuk vezet.
(a) kbind a cRafRBD koncentráció függvényében. Összehasonlításként a kbind lineáris növekedése látható. (b) kdiss a cRafRBD koncentráció függvényében. összehasonlításként az 1j. ábrán látható kísérletből származó kblinking látható. A hibasávok az s.e.-t jelölik (n>180). (c-e) A HRas-cRafRBD kölcsönhatás valós idejű nyomvonalai. Vegyük észre, hogy a háttérfluoreszcencia a felszíni HRas-sűrűséggel együtt nő. Ugyanazt a =10 nM prédakoncentrációt használtuk. (f) A háttérfluoreszcencia növekedése a felületi HRas sűrűség függvényében. A 10 nM (piros körök), 20 nM (zöld háromszögek) eGFP-cRafRBD-vel és 20 nM rekombináns eGFP-vel (kék rombuszok) kapott három adatsort a megfelelő háttérfluoreszcencia-szinttel normalizáltuk, amelyet alacsony, 0,38 HRas/μm2 -es felületi Ras-sűrűség mellett mértünk. A hibasávok s.d. értékeket jelölnek (n>100). (g) Egymolekulás tüskefrekvencia a háttérfluoreszcencia függvényében. A 10 nM eGFP-cRafRBD-vel kapott adatsort használjuk. A hibasávok s.e. értékeket jelölnek (n>100).
Figyelemre méltó, hogy a HRas felületi sűrűségének változtatásával láthatóvá tehetjük a találkozó komplexeket. Ha a háttérfluoreszcencia az eGFP-cRafRBD Brown-mozgásának egyszerű terméke lenne, akkor kizárólag az ömlesztett cRafRBD koncentrációjától függne. A háttér-fluoreszcencia azonban meredeken növekszik a HRas felületi sűrűségével, még akkor is, ha a cRafRBD koncentráció állandó (2c-f ábra). Magas, 6,4 HRas/μm2 -es Ras-sűrűségnél a teljes háttérfluoreszcencia háromszor akkora, mint a 0,38 HRas/μm2 -es sűrűségnél megfigyelt (2c. ábra). Numerikus szimulációnk azt mutatja, hogy a párhuzamos kötődési folyamatok jelenléte egy adott ROI-ban a megfigyelt növekedésnek csak kevesebb mint 5%-áért felelős (S9. kiegészítő ábra). Továbbá, amikor a prédafehérjéket rekombináns eGFP-re cseréltük, amelyek nem lépnek kölcsönhatásba a felületen immobilizált HRas fehérjékkel, a háttér-fluoreszcenciájuk lényegében változatlan volt az általunk vizsgált HRas sűrűségtartományban (2f. ábra, kék rombuszok). Így, mivel a felszínen sűrű aktív HRas-populációval rendelkezünk, úgy tűnik, hogy valóban több eGFP-cRafRBD molekula tartózkodik a felszín felett, mint amennyit a tiszta Brown-diffúzió alapján várnánk. Ezek a találkozási komplexek a HRas és a cRafRBD fehérjék24 közötti gyors, kiegyenlítődést megelőző kölcsönhatásokból erednek, amelyek dinamikája meghaladja időbeli felbontásunkat.
A következő kérdésünk az volt, hogy a találkozási komplexek valóban szubsztrátként szolgálnak-e a végső HRas-cRafRBD komplex számára. Ebből a célból felmértük az egyetlen felületen immobilizált HRas fehérje által generált fluoreszcencia tüskék gyakoriságát. Arra a következtetésre jutottunk, hogy ha a találkozási komplexek valóban a végső Ras-Raf-komplex útvonali intermedierjei, akkor az egymolekulás tüskék gyakoriságának az azonos ömlesztett cRafRBD-koncentráció ellenére a háttérfluoreszcencia növekedésével együtt kell növekednie. Az egymolekulás tüskefrekvencia HRas-sűrű környezetben történő meghatározásához a kbind-ot egy kisebb, 3 x 3 pixeles ROI (0,18 μm2) segítségével mértük, és a mért kbind-értéket elosztottuk az egyes 3 x 3 pixeles ROI-kban lévő HRas-ok átlagos számával (S10. kiegészítő ábra). Nagyjából ez az egymolekulás tüskefrekvencia a háttérfluoreszcenciával együtt nőtt (2g. ábra, 10 nM eGFP-cRafRBD-t használtunk). Megfigyelésünk arra utal, hogy a koncentrált downstream fehérjék találkozási komplexek formájában fokozott gyakorisággal vezetnek a Ras-Raf komplex kialakulásához.
Szignálfehérjék egymolekulás co-IP analízise rákos megbetegedésekben
Előtte bemutattuk a fehérje-fehérje kölcsönhatás kinetikájának valós idejű mérését egymolekulás co-IP során. Ezekben a kísérletekben azonban a csali- és zsákmányfehérjéket fluoreszcens fehérjecímkékkel fuzionáltuk, ami felveti a kérdést, hogy kiterjeszthetjük-e ezt a technikát natív fehérjékre. Ebből a célból mutált HRas-t (G12V) expresszáltunk egy nem tumorigén humán emlőepiteliális sejtvonalban (MCF10A), hogy rákos sejtekké alakítsuk őket25 (3a. ábra). Ezek a transzformált sejtek, amelyek szérummentes növekedést mutattak (S11. kiegészítő ábra), tumorokat képeztek, amikor immunhiányos egerek emlőzsírpárnájába injektáltuk őket (3b. ábra). A tumorszöveteket 17 nappal a xenograft beültetése után nyertük, a kontrollszöveteket pedig kezeletlen meztelen egerek azonos részeiből készítettük.
(a,b) MCF10A sejtek átalakulása rákos sejtekké retrovírusos HRas (G12V) transzdukcióval. Ez az egypontos mutáció köztudottan konstitutívan aktívvá teszi a HRas-t. A rákos sejtek befecskendezése meztelen egerek emlőpárnájába tumorképződéshez vezet. Méretsáv: 5 mm. (c) Az egymolekulás western blot analízis vázlata. A sejtes és a szonda Ras közötti versengés az elsődleges antitesthez való kötődésért csökkenti a specifikusan a felszínhez kötött szonda Ras számát, ami következésképpen csökkenti a fluoreszcens foltok számát. Vegyük észre, hogy mivel minden primer antitest két Ras-fehérjéhez kötődik, egy fluoreszcens folt eltűnik, ha a két fénylánc kar közül mindkettőt a sejtes Ras foglalja el. (d) Prototípusos egymolekulás western blot mérés. Célfehérjeként 298 nM mCherry-HRas-t használtunk. Szondaként 32,5 nM eGFP-HRas-t használva a célfehérje koncentrációja 288±1,4 nM volt. A hibasáv az s.d. értéket jelöli (n=20). (e) Az a,b-től a tumorigenezis folyamatán keresztül mért Ras expressziós szintek. A hibasávok s.d.-t jelölnek (n=20). (f) A natív HRas valós idejű co-IP képalkotásának vázlata. (g-j) A co-IP képalkotás valós idejű nyomvonalai. A pull downhoz használt HRas koncentrációk 3,0 (g), 41,3 (h), 3,5 (i) és 49 nM (j). A fluoreszcencia tüskék gyakorisága jelentősen megnőtt a rákszöveti kivonat esetében, amikor a HRas pull-down-t 1,6-ról 22 HRas per μm2-re növeltük (g versus h). Ez nem volt megfigyelhető a kontroll szövetkivonatnál (i versus j). (k) A kbind infláció vázlata. A felszínen lévő aktív csalétek ritkás körülményei között állandó, egymolekulás kbind-ot kapunk még akkor is, ha a csalétek felszíni lehúzódását növeljük (bal oldali két panel). A 0,6 aktív csali/μm2 -nél lévő küszöbérték felett azonban ROI-nként átlagosan több mint egy csali van jelen. Ez a több csalétek az egyes ROI-kon mért kbind növekedését eredményezi (jobb oldali panel). (l) A kbind a HRas lehúzás függvényében. A hibasávok s.e. értékeket jelölnek (n>180).
A tumorigenezis kvantitatív leírására antitestek tandemrétegeit használtuk; egy felületen immobilizált biotinilált másodlagos antitestet és egy Ras-specifikus primer antitestet1,2 . Ez lehetővé tette a natív, nem jelölt Ras, valamint a jelölt Ras befogását (3c. ábra). Először a Ras expressziós szintjét követtük nyomon kvantitatív módon a tumorigenezis folyamatán keresztül. A sejt- vagy szövetkivonatokat hígított HEK293 sejtlizátummal kevertük, amely ismert koncentrációjú Ras-szondát (eGFP-HRas) tartalmazott. Az elsődleges antitest kötőhelyeit teljesen telítő reakciókörülmények között ez a keveredés a Ras-specifikus antitest kötődéséért való versengéshez vezet a szonda Ras és a célsejtes Ras között (3c. ábra, balra). Az elsődleges antitestekhez kötött szonda Ras molekulák száma csökken a célsejtes Ras koncentrációjának növekedésével. Ez a kompetitív kötődés csökkenti a fluoreszcens foltok számát a felszínen (3c. ábra, jobbra), ami a 
egyenletet követi, ha normalizáljuk a csak szonda Ras kötődési feltételhez (S12. kiegészítő ábra). A megkötött szondamolekulák számának mérésével több különböző hígításban specifikusan és robusztusan tudtuk mérni a célsejtek Ras moláris koncentrációját sejt- és szövetkivonatokban (3d. ábra és Kiegészítő ábra S12). Ez az egymolekulás Western blot-elemzés 42 és 59 nM Ras-expressziós szintet jelzett a rákos MCF10A sejtek és a xenograft tumorszövetek 1 mg ml-1 extraktumaiban, míg a kontrollszövetek 1 mg ml-1 extraktumaiban 7 nM alapszintet mértünk (3e. ábra).
Ezeken túlmenően az 1. és 2. ábrán bemutatott valós idejű egymolekulás co-IP képalkotást is meg tudtuk ismételni ezen a natív Ras-fogó felületen. Miután a tumor- vagy kontrollszöveti kivonatokból származó HRas-t lehúztuk a tandem antitest felületre, egy szondasejt lizátumot, egy 20 nM eGFP-cRafRBD prédafehérjékkel hígított HEK293 sejt lizátumot vittünk fel (3f. ábra). A valós idejű co-IP nyomokat elemeztük, hogy meghatározzuk a kbind és kdiss kinetikai sebességeket (3g-j. ábra). Fontos megjegyezni, hogy az egymolekulás Western blot-elemzésből származó koncentrációs információ (3e. ábra) döntő fontosságú volt a meghatározott HRas-koncentráció biztosításához minden egyes pull downhoz, amikor a tumor- és kontrollszövet-kivonatok eltérő HRas-expressziós szintekkel rendelkeztek. A felületi lehúzás kalibrációs adatainak felhasználásával (S13. kiegészítő ábra) a koncentrációs információt végül a lehúzott HRas-fehérjék specifikus felületi sűrűségévé alakítottuk át (3g-j. ábra).
Szisztematikusan vizsgáltuk a kbind változását a lehúzott HRas-fehérjék felületi sűrűségének pontos növelése során (3k. ábra). Feltételezzük, hogy a celluláris szabályozás eredményeként a HRas fehérjéknek csak egy részhalmaza lehet a felszínen GTP-vel töltött állapotban és mutathat aktív kötődési eseményeket a prédafehérjékkel. Olyan ritka körülmények között, amelyben a szomszédos aktív HRas molekulák közötti távolság jóval nagyobb, mint az egyes ROI-k átmérője, az egyes ROI-kból megfigyelt kinetikának függetlennek kell lennie a teljes HRas felszíni immobilizációtól, és egyszerűen az egyes HRas fehérjék aktivitásáról kell beszámolnia (3k. ábra, bal oldali két panel és a Kiegészítő S14 ábra). Ahogy a felület egyre zsúfoltabbá válik aktív HRasokkal, úgy kell lennie egy küszöbértéknek, amelynél ROI-nként egynél több aktív HRas molekula kezd megjelenni. Ha ezt a küszöbértéket átlépjük, az egyes ROI-kban lévő további aktív HRas molekulák további fluoreszcencia tüskéket produkálnak, amelyek következésképpen a kbind értékét növelik (3k. ábra, jobb oldali panel és a Kiegészítő ábra S14). Valóban megfigyeltük a kbind ilyen kétfázisú tendenciáját a tumorszövetben, a küszöbérték ~3 HRas lehúzott μm2 -enként (3l. ábra).
Ezért a kbind felfúvódásához szükséges küszöbérték alatt a megfigyelt tüskekinetika nagyrészt az egyes HRas molekulák aktivitását tükrözné. Figyelemre méltó, hogy 1,6-1,9 HRas lehúzása esetén μm2 -enként 0,28 s-1 és 0,22 s-1 hasonló kbind értékeket figyeltünk meg a daganatos és a kontrollszövetből származó HRas fehérjék esetében (3l. ábra). A kdiss mérések 2,5 s-1 értéken is nagyon hasonlóak voltak (S15. kiegészítő ábra). A tumorból származó egy onkogén HRas látszólagos disszociációs állandója következésképpen 180 nM volt, és ez nagyon hasonló volt a kontrollszöveti kivonatból származó aktív HRas 230 nM disszociációs állandójához. Megfigyeléseink arra a döntő fontosságú tényre utalnak, hogy az onkogén HRas egymolekulás aktivitása nem különbözik drámaian az aktivált vad típusú HRas aktivitásától.
Mi különbözteti meg akkor ezt a rákos állapotot a normális állapottól? A kbind inflációs küszöbérték lehetővé teszi számszerűsíteni a sejtszignálfehérjék egy másik fontos statisztikáját, a cRafRBD-vel aktívan kötődő HRas-fehérjék arányát. Intuitív módon a kbind infláció küszöbértékének meg kell felelnie az “aktív” csalifehérjék meghatározott felületi sűrűségének. A mi képalkotó rendszerünkben ez a küszöbérték 0,6 aktív csali per μm2 -nél volt, ami nem függ a csali- és prédafehérjék részletes típusától (Kiegészítő ábra S13). Mivel a kbind infláció küszöbértékét a μm2 -enként összesen 3 lehúzott HRas-nál figyeltük meg, az aktív HRas-ok frakcióját közvetlenül 20%-ra becsültük a tumorszövetben. Ezzel szemben nem tudtunk kbind-inflációt megfigyelni, amikor a kontrollszövetből még 25 HRas fehérjét is lehúztunk μm2 -enként (3l. ábra). Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a tumorszövetből származó onkogén HRas egy nagyságrenddel nagyobb aktív frakcióval rendelkezik, mint a kontrollszövetből származó HRas.
Végezetül feltettük a kérdést, hogy az aktív Ras ezen magasabb aránya lehet-e egyszerűen a xenograftolt tumorban lévő HRas túlterjedésének a következménye. A felülreprezentált HRas-fehérjék túlerőltethetik a feltételezett kötőpartnereket, amelyek az eGFP-vel jelölt Raf-hoz való kötődéshez rendelkezésre állnak. E kérdés közvetlen megválaszolása érdekében két humán emlőrákos sejtvonalat vizsgáltunk, az MCF-7-et, amely vad típusú KRas-szal rendelkezik, és az MDA-MB-231-et, amely a KRas egy mutáns formájával (G13D; 4. ábra). Különösen az MDA-MB-231 sejtekről ismert, hogy onkogén-függőséget mutatnak a mutáns KRas génhez, és túlélésük kritikusan függ az aberráns KRas jelátviteltől26,27. E két sejtvonal segítségével azt is meg tudjuk állapítani, hogy módszereink alkalmazhatók-e a KRas jelátvitelre, amely számos humán rákos megbetegedés molekuláris diagnosztikájában és kezelésében kulcsfontosságú28.
(a,b) A KRas expressziós szintjének egymolekulás western blot elemzése. eGFP-vel jelölt KRas-t használtunk Ras szondaként. A vad típusú KRas expressziós szintje az MCF-7 vonalban 17,3±1,3 nM, míg a G13D mutáns KRasé az MDA-MB-231 vonalban 5,5±0,3 nM volt 1 mg ml-1 extraktumonként. A hibasávok s.d. értékeket jelölnek (n=200). (c) A kbind a KRas lehúzásának függvényében. Vegyük észre, hogy a vad típusú és a mutáns KRas azonos kbind értéket osztott meg az egymolekulás kinetikai tartományban (a közös lapos vonal). A kbind küszöbértékét az MDA-MB-231-ből származó mutáns KRas esetében 1,2 lehúzott KRas per μm2 -nél mértük, ami 50%-os becsült aktív frakciót eredményezett. Ez az érték egy nagyságrenddel magasabb volt, mint az MCF-7-ből származó vad típusú KRas 6%-a, amelynek küszöbértéke 10 lehúzott KRas per μm2 volt. A hibasávok s.e. értékeket jelölnek (n>150).
Ezekből a sejtkivonatokból közvetlenül KRas-specifikus primer ellenanyaggal húztuk le a KRas-t. Egymolekulás western blot analízisünk azt mutatta, hogy a vad típusú KRas koncentrációja az MCF-7 sejtekben magasabb (17 nM), mint a mutáns KRasé az MDA-MB-231 sejtekben (5,5 nM 1 mg ml-1 extraktumban; 4a. ábra és S16. kiegészítő ábra). Tekintettel az MDA-MB-231 sejtek KRas onkogén-függőségére, kisebb KRas-expressziós szintjük meglehetősen váratlan megfigyelés volt. Ráadásul a vad típusú és a mutáns KRas egymolekulás jelátviteli kinetikája lényegében megegyezik (4c. ábra, a közös lapos vonal; a kdiss-t lásd a Kiegészítő S15. ábrán). Másrészt a valós idejű egymolekulás co-IP-ünk megoldja, hogy az MDA-MB-231-ből származó mutáns KRas esetében a kbind infláció küszöbértékét 1,2 μm2 -enként lehúzott KRas-nál azonosítottuk, míg az MCF-7-ből származó vad típusú KRas esetében a küszöbérték ~10 μm2 -enként lehúzott KRas-nál figyelhető meg (4c. ábra). Mivel a kbind infláció mindig 0,6 aktív csalit per μm2-nél következik be, ezek az eltérő küszöbértékek közvetlenül azt jelzik, hogy a mutáns KRas aktív frakciója, amely erősen kötődik a downstream célpontjához (15 nM cRafRBD), 50%, ami majdnem egy nagyságrenddel magasabb, mint a vad típusú KRas által mutatott 6%. Így az onkogén mutáns Ras mutáns által mutatott magasabb aktív frakció egyértelműen nem túlterjedési artefaktum, mivel a mutáns KRas alacsonyabb szinten expresszálódott, de magasabb aktív frakciót mutatott, mint a vad típus.
.