Tandem tömegspektrometria

A gázfázisú ionok fragmentációja alapvető fontosságú a tandem tömegspektrometriában, és a tömegelemzés különböző szakaszai között történik. Az ionok fragmentálására számos módszert alkalmaznak, és ezek különböző típusú fragmentációt eredményezhetnek, és így különböző információkat a molekula szerkezetéről és összetételéről.

Forráson belüli fragmentációSzerkesztés

Az ionizációs folyamat gyakran elég heves ahhoz, hogy a keletkező ionoknak elegendő belső energiájuk maradjon a tömegspektrométeren belüli fragmentációhoz. Ha a termékionok az automatikus disszociáció előtt mérsékelt ideig nem egyensúlyi állapotukban maradnak, ezt a folyamatot metastabil fragmentációnak nevezzük. A fúvóka-skimmer fragmentáció a forráson belüli fragmentáció célzott előidézésére utal a fúvóka-skimmer potenciál növelésével az általában elektrospray-alapú műszereken. Bár a forráson belüli fragmentáció lehetővé teszi a fragmentációs elemzést, technikailag ez nem tandem tömegspektrometria, hacsak a metastabil ionok tömegelemzése vagy kiválasztása nem történik meg az autodiszszociáció előtt, és a keletkező fragmentumokon nem végeznek egy második elemzési szakaszt. Az in-source fragmentáció a tandem tömegspektrometria helyett is használható az Enhanced in-Source Fragmentation Annotation (EISA) technológia alkalmazásával, amely a tandem tömegspektrometriás adatokkal közvetlenül megegyező fragmentációt hoz létre. Az EISA által megfigyelt fragmentumok nagyobb jelintenzitással rendelkeznek, mint a hagyományos fragmentumok, amelyek a tandem tömegspektrométerek ütközési celláiban veszteségeket szenvednek. Az EISA lehetővé teszi a fragmentációs adatgyűjtést MS1 tömeganalizátorokon, például repülési idővel működő és egynégypólusú műszereken. Az in-source fragmentációt gyakran használják a tandem tömegspektrometria mellett (post-source fragmentációval), hogy egy pszeudo MS3 típusú kísérletben két fragmentációs lépést tegyenek lehetővé.

Ütközés-indukált disszociációSzerkesztés

A tandem tömegspektrometriás kísérletben leggyakrabban a post-source fragmentációt használják. Az általában már rezgésgerjesztett ionokhoz energiát lehet hozzáadni semleges atomokkal vagy molekulákkal való forrás utáni ütközésekkel, sugárzás elnyelésével, vagy egy elektron átadásával vagy befogásával egy többszörösen töltött ion által. Az ütközés-indukált disszociáció (CID), más néven ütközéssel aktivált disszociáció (CAD), egy ion ütközése egy semleges atommal vagy molekulával a gázfázisban és az ion ezt követő disszociációja. Vegyük például

AB + + M ⟶ A + B + + + M {\displaystyle {\ce {{{AB+}+ M -> {A}+ {B+}+ M}}}}}

ahol az AB+ ion ütközik a semleges M fajjal, majd szétesik. Ennek a folyamatnak a részleteit az ütközéselmélet írja le. Az eltérő műszeres konfiguráció miatt két fő különböző CID-típus lehetséges: (i) sugár típusú (amelyben a prekurzorionokat a repülés során fragmentálják) és (ii) ioncsapda típusú (amelyben a prekurzorionokat először csapdába ejtik, majd fragmentálják).

A CID-fragmentáció harmadik és újabb típusa a nagyobb energiájú ütközéses disszociáció (HCD). A HCD az orbitrap tömegspektrométerekre jellemző CID-technika, amelyben a fragmentáció az ioncsapdán kívül, a HCD-cellában (egyes műszerekben “ionútvonal-multipólusnak” nevezett) történik. A HCD egy csapda típusú fragmentáció, amelyről kimutatták, hogy sugár típusú jellemzőkkel rendelkezik. Léteznek szabadon hozzáférhető nagyméretű, nagy felbontású tandem tömegspektrometriás adatbázisok (pl. a METLIN, amely 850 000 molekulastandardot tartalmaz, egyenként kísérleti CID MS/MS adatokkal), és jellemzően kis molekulák azonosításának megkönnyítésére használják.

Elektronbefogási és -átadási módszerekSzerkesztés

A többszörösen töltött ionra történő elektronátadás vagy elektronbefogás során felszabaduló energia fragmentációt idézhet elő.

Elektronbefogási disszociációSzerkesztés

Ha egy többszörösen töltött pozitív ionhoz elektront adunk, a Coulomb-energia felszabadul. A szabad elektron hozzáadását elektronbefogási disszociációnak (ECD) nevezzük, és a következőképpen ábrázoljuk:

n + + e – ⟶ ( n – 1 ) + ] ∗ ⟶ töredékek {\displaystyle ^{n+}+{\ce {e^{-}->}}}\left^{(n-1)+}\right]^{*}{\ce {->töredékek}}}}

többszörösen protonált M molekulára.

Elektronátviteli disszociációSzerkesztés

Az elektron ion-ion reakcióval történő hozzáadását elektronátviteli disszociációnak (ETD) nevezzük. Az elektronbefogásos disszociációhoz hasonlóan az ETD a kationok (pl. peptidek vagy fehérjék) fragmentálódását idézi elő elektronok átadásával. Donald F. Hunt, Joshua Coon, John E. P. Syka és Jarrod Marto találta fel a Virginiai Egyetemen.

Az ETD nem szabad elektronokat használ, hanem radikális anionokat (pl. antracén vagy azobenzol) alkalmaz erre a célra:

n + + A – ⟶ ( n – 1 ) + ] ∗ + A ⟶ töredékek {\displaystyle ^{n+}+{\ce {A^{-}->}}}\left^{(n-1)+}\right]^{*}+{\ce {A->töredékek}}}}

ahol A az anion.

ETD véletlenszerűen hasítja a peptidgerinc mentén (c és z ionok), míg az oldalláncok és az olyan módosítások, mint a foszforiláció érintetlenül maradnak. A technika csak a magasabb töltésállapotú ionok (z>2) esetében működik jól, azonban az ütközésindukált disszociációhoz (CID) képest az ETD előnyös a hosszabb peptidek vagy akár teljes fehérjék fragmentálásánál. Ez teszi a technikát fontossá a top-down proteomika számára. Az ECD-hez hasonlóan az ETD is hatékony az olyan módosításokkal rendelkező peptidek esetében, mint például a foszforiláció.

Az elektrontranszfer és a magasabb energiájú ütközéses disszociáció (EThcD) az ETD és a HCD kombinációja, ahol a peptid prekurzort először ion/ion reakciónak vetik alá fluorantén anionokkal egy lineáris ioncsapdában, amely c- és z-ionokat hoz létre. A második lépésben HCD all-ion fragmentációt alkalmaznak az összes ETD-eredetű ionra, hogy b- és y-ionokat hozzanak létre a végső analízis előtt az orbitrap analizátorban. Ez a módszer kettős fragmentációt alkalmaz, hogy ion- és így adatgazdag MS/MS-spektrumokat hozzon létre peptidszekvenáláshoz és PTM-lokalizációhoz.

Negatív elektronátviteli disszociációSzerkesztés

A fragmentáció egy deprotonált fajjal is előfordulhat, amikor egy elektron átkerül a fajról egy kationos reagensre negatív elektronátviteli disszociáció (NETD) során:

n – + A + ⟶ ( n + 1 ) – ] ∗ + A ⟶ töredékek {\displaystyle ^{n-}+{\ce {A+->}}}\left^{(n+1)-}\right]^{*}+{\ce {A->töredékek}}}}

Az elektronhiányos anion ezt az átadási eseményt követően belső átrendeződésen megy keresztül és fragmentálódik. A NETD az elektron-detachment disszociáció (EDD) ion/ion analógja.

A NETD kompatibilis a peptidek és fehérjék fragmentálódásával a gerinc mentén a Cα-C kötésnél. A keletkező fragmentumok általában a– és x-típusú termékionok.

Electron-detachment dissociationEdit

Az elektron-detachment disszociáció (EDD) egy módszer anionos fajok fragmentálására a tömegspektrometriában. Az elektronbefogásos disszociáció negatív ellenmódjaként szolgál. A negatív töltésű ionokat mérsékelt kinetikus energiájú elektronokkal történő besugárzással aktiválják. Az eredmény az elektronok kilökődése a kiindulási ionmolekulából, ami rekombinációval történő disszociációt okoz.

Töltésátviteli disszociációSzerkesztés

A pozitív töltésű peptidek és a kationos reagensek közötti reakció, más néven töltésátviteli disszociáció (CTD), a közelmúltban az alacsony töltésállapotú (1+ vagy 2+) peptidek alternatív, nagy energiájú fragmentációs útvonalaként mutatkozott be. A hélium-kationokat reagensként használó CTD javasolt mechanizmusa a következő:

1 + + + He + ⟶ 2 + ] ∗ + He 0 ⟶ töredékek {\displaystyle {\ce {{^{1}+}+He+->}}}\left^{2}+}}}\right]^{*}+{\ce {He^{0}->töredékek}}}}

Az első jelentések szerint a CTD peptidek gerinc Cα-C kötéseinek hasadását okozza és a– és x-típusú termékionokat szolgáltat.

FotodiszszociációSzerkesztés

A disszociációhoz szükséges energiát fotonelnyeléssel lehet hozzáadni, ami ion fotodiszszociációt eredményez, és a

AB + + h ν ⟶ A + B + {\displaystyle {\ce {{{AB+}+{\mathit {h\nu }}->{A}+B+}}}}}

hol h ν {\displaystyle h\nu }

az ion által elnyelt fotont jelenti. Ultraibolya lézerek is használhatók, de a biomolekulák túlzott fragmentálódásához vezethetnek.

Infravörös multifoton disszociációSzerkesztés

Az infravörös fotonok felmelegítik az ionokat, és disszociációt okoznak, ha elég sokat nyelnek el belőlük. Ezt a folyamatot infravörös multifoton-dissociációnak (IRMPD) nevezik, és gyakran szén-dioxid lézerrel és ioncsapdás tömegspektrométerrel, például FTMS-sel végzik.

Fekete test infravörös sugárzásos disszociációEdit

A fekete test sugárzása használható fotodissociációra a fekete test infravörös sugárzásos disszociációnak (BIRD) nevezett technikában. A BIRD-módszerben a tömegspektrométer teljes vákuumkamráját felhevítik, hogy infravörös fényt hozzanak létre. A BIRD ezt a sugárzást használja fel az ionok egyre energikusabb rezgéseinek gerjesztésére, amíg egy kötés el nem szakad, és szilánkok keletkeznek. Ez hasonlít az infravörös multifoton-dissociációhoz, amely szintén infravörös fényt használ, de más forrásból. A BIRD-t leggyakrabban Fourier-transzformációs ionciklotron-rezonancia tömegspektrometriával használják.

Felület-indukált disszociációSzerkesztés

A felület-indukált disszociáció (SID) esetében a fragmentáció az ionnak egy felülettel való ütközésének eredménye nagy vákuumban. Napjainkban a SID-t az ionok széles skálájának fragmentálására használják. Évekkel ezelőtt csak az alacsonyabb tömegű, egyszeres töltésű fajoknál volt gyakori a SID alkalmazása, mivel az ionizációs módszerek és a tömegelemző technológiák nem voltak elég fejlettek a nagy m/z-értékű ionok megfelelő kialakításához, továbbításához és jellemzéséhez. Idővel az aranyon lévő CF3(CF2)10CH2CH2CH2S-ből álló önszerveződő monorétegfelületek (SAM) lettek a tandemspektrométerben a SID-hez leggyakrabban használt ütközési felületek. A SAM-ek a legkívánatosabb ütközési célpontok, mivel jellemzően nagy effektív tömegűek a beérkező ionok ütközéséhez. Ráadásul ezek a felületek merev fluorkarbonláncokból állnak, amelyek nem csillapítják jelentősen a lövedékionok energiáját. A fluorkarbonláncok azért is előnyösek, mert képesek ellenállni a fémfelületről a beérkező ionokra történő könnyű elektronátvitelnek. A SID-nek az a képessége, hogy olyan alkomplexeket hoz létre, amelyek stabilak maradnak és értékes információt szolgáltatnak a kapcsolódásról, semmilyen más disszociációs technikához nem hasonlítható. Mivel a SID által előállított komplexek stabilak és megtartják a töltés eloszlását a fragmentumon, ez egyedi spektrumot eredményez, amelynek középpontjában a komplex egy szűkebb m/z eloszlás körül helyezkedik el. A SID-termékek és az energia, amelynél kialakulnak, tükrözik a komplex erősségét és topológiáját. Az egyedi disszociációs mintázatok segítenek felfedezni a komplex kvaterner szerkezetét. A szimmetrikus töltéseloszlás és a disszociációs függés egyedülálló a SID-ben, és az előállított spektrumokat megkülönbözteti bármely más disszociációs technikától.

A SID technika alkalmazható az ion-mobilitás tömegspektrometriában (IM-MS) is. E technika három különböző módszere a topológia, az alegységek közötti kapcsolódás és a fehérjeszerkezet kibontakozásának mértékének jellemzésére szolgáló elemzésekre terjed ki. A fehérjeszerkezet kibontakozásának elemzése a SID technika leggyakrabban használt alkalmazása. Az ion-mobilitás tömegspektrometria (IM-MS) esetében a SID-t három különböző típusú fehérjekomplex forrásaktivált prekurzorainak disszociációjára használják: C-reaktív fehérje (CRP), transtiretin (TTR) és konkanavalin A (Con A). Ezzel a módszerrel megfigyelhető az egyes komplexek kibomlási foka. Ehhez a megfigyeléshez a SID megmutatta a prekurzorionok szerkezetét, amelyek a felülettel való ütközés előtt léteznek. Az IM-MS az SID-t az egyes fehérjék alegységeinek konformációjának közvetlen mérésére használja.

A Fourier-transzformációs ionciklotron-rezonancia (FTICR) képes ultranagy felbontást és nagy tömegpontosságot biztosítani a tömegméréseket végző műszerek számára. Ezek a tulajdonságok az FTICR tömegspektrométereket hasznos eszközzé teszik a legkülönbözőbb alkalmazásokhoz, például számos disszociációs kísérlethez, mint például az ütközés indukálta disszociáció (CID), az elektronátviteli disszociáció (ETD) és mások. Ezenkívül a felületindukált disszociációt is megvalósították ezzel a műszerrel az alapvető peptidfragmentáció tanulmányozására. Konkrétan az SID-t a gázfázisú fragmentáció energetikájának és kinetikájának tanulmányozására alkalmazták egy ICR műszeren belül. Ezt a megközelítést a protonált peptidek, a páratlan elektronú peptidionok, a nem kovalens ligandum-peptid komplexek és a ligált fémklaszterek gázfázisú fragmentációjának megértésére használták.