Főbb enzimek és komponensekSzerkesztés
A V(D)J-rekombináció folyamatát a VDJ-rekombináz közvetíti, amely enzimek változatos gyűjteménye. Az érintett kulcsenzimek a rekombinációt aktiváló gén 1 és 2 (RAG), a terminális dezoxinukleotidiltranszferáz (TdT) és az Artemis nukleáz, a DNS-javítás ubiquitását biztosító nem-homológ végcsatlakozási útvonal (NHEJ) egyik tagja. Számos más enzimről is ismert, hogy részt vesz a folyamatban, ezek közé tartozik a DNS-függő fehérje kináz (DNA-PK), az X-ray repair cross-complementing protein 4 (XRCC4), a DNS ligáz IV, a nem-homológ vég-összekötő faktor 1 (NHEJ1; más néven Cernunnos vagy XRCC4-like factor ), az XRCC4 és az XLF nemrég felfedezett paralógja (PAXX), valamint a λ és μ DNS-polimerázok. Egyes résztvevő enzimek specifikusak a limfocitákra (pl. RAG, TdT), míg mások más sejttípusokban, sőt ubiquitikusan is megtalálhatóak (pl. NHEJ komponensek).
A rekombináció specifitásának fenntartása érdekében a V(D)J rekombináz felismeri a változó (V), a diverzitás (D) és a csatlakozó (J) génszakaszokat flankáló rekombinációs jelszekvenciákat (RSS), és azokhoz kötődik. Az RSS-ek három elemből állnak: egy hét konzervált nukleotidból álló heptamer, egy 12 vagy 23 bázispár hosszúságú spacer régió és egy kilenc konzervált nukleotidból álló nonamer. Bár az RSS-ek többsége szekvenciájában eltér, a konszenzus heptamer és nonamer szekvenciája CACAGTG, illetve ACAAAAACC; és bár a spacer régió szekvenciája kevéssé konzervált, a hossza nagymértékben konzervált. A spacer régió hossza körülbelül a DNS-hélix egy (12 bázispár) vagy két (23 bázispár) fordulatának felel meg. Az úgynevezett 12/23 szabály szerint a rekombinálandó génszakaszok általában különböző hosszúságú RSS-ekkel szomszédosak (azaz az egyiknek “12RSS”, a másiknak “23RSS” van). Ez fontos jellemző a V(D)J rekombináció szabályozásában.
ProcessEdit
A V(D)J rekombináció akkor kezdődik, amikor a V(D)J rekombináz (a RAG1 aktivitása révén) egy kódoló génszakaszt (V, D vagy J) flankáló RSS-hez kötődik, és egyszálú bevágást hoz létre a DNS-ben az RSS első bázisa (közvetlenül a heptamer előtt) és a kódoló szegmens között. Ez energetikailag lényegében semleges (nincs szükség ATP-hidrolízisre), és egy szabad 3′ hidroxilcsoport és egy 5′ foszfátcsoport kialakulását eredményezi ugyanazon a szálon. A reaktív hidroxilcsoportot a rekombináz úgy helyezi el, hogy megtámadja az ellentétes szál foszfodiészterkötését, két DNS-véget képezve: egy hajtű (szárhurok) a kódoló szegmensen és egy tompa vég a jelzőszegmensen. A jelenlegi modell szerint a DNS-nickelés és a hajtűképződés mindkét szálon egyszerre (vagy majdnem egyszerre) történik egy rekombinációs központnak nevezett komplexben.
A tompa jelvégeket öblítéssel ligálják össze, hogy egy kör alakú DNS-darabot alkossanak, amely tartalmazza a kódoló szegmensek közötti összes közbeeső szekvenciát, az úgynevezett jelkötést (bár kör alakú, ez nem tévesztendő össze a plazmiddal). Bár eredetileg úgy gondolták, hogy az egymást követő sejtosztódások során elveszik, vannak bizonyítékok arra, hogy a szignálkötések újra bekerülhetnek a genomba, és az onkogének aktiválásával vagy a tumorszupresszor gén(ek) működésének megszakításával patológiákhoz vezethetnek.
A kódoló végeket a ligálás előtt több olyan esemény révén tovább dolgozzák fel, amelyek végül a kötés sokféleségéhez vezetnek. A feldolgozás akkor kezdődik, amikor a DNS-PK minden egyes elszakított DNS-véghez kötődik, és számos más fehérjét toboroz, köztük az Artemis, az XRCC4, a DNS-ligáz IV, a Cernunnos és számos DNS-polimeráz. A DNA-PK komplexet alkot, amely autofoszforilációjához vezet, ami az Artemis aktiválódását eredményezi. A kódoló végű hajszálakat az Artemis aktivitása nyitja meg. Ha középen nyílnak, akkor tompa DNS-vég keletkezik; sok esetben azonban a nyitás “középponton kívül” történik, és azt eredményezi, hogy az egyik szálon extra bázisok maradnak (túlnyúlás). Ezeket palindromikus (P) nukleotidoknak nevezik a DNS-javító enzimek által a túlnyúlás feloldásakor keletkező szekvencia palindromikus jellege miatt. Az Artemis által végzett hajtűnyitás folyamata a V(D)J rekombináció egyik kulcsfontosságú lépése, és a súlyos kombinált immunhiányos (scid) egérmodellben hibás.
A következő lépésben az XRCC4, a Cernunnos és a DNA-PK igazítja a DNS-végeket, és toborozza a terminális dezoxinukleotidiltranszferázt (TdT), egy sablonfüggetlen DNS-polimerázt, amely nem-templált (N) nukleotidokat ad a kódoló véghez. A hozzáadás többnyire véletlenszerű, de a TdT előnyben részesíti a G/C nukleotidokat. Mint minden ismert DNS-polimeráz, a TdT is 5′ és 3′ irányban ad hozzá nukleotidokat az egyik szálhoz.
Végül az exonukleázok képesek bázisokat eltávolítani a kódoló végekről (beleértve az esetlegesen képződött P vagy N nukleotidokat is). A λ és μ DNS-polimerázok ezután szükség szerint további nukleotidokat illesztenek be, hogy a két véget kompatibilissé tegyék az egyesítéshez. Ez egy sztochasztikus folyamat, ezért a P- és N-nukleotidok hozzáadásának és az exonukleolitikus eltávolításának bármilyen kombinációja előfordulhat (vagy egyik sem). Végül a feldolgozott kódoló végeket a DNS-ligáz IV ligálja össze.
Mindezek a feldolgozási események olyan paratopot eredményeznek, amely nagyon változó, még akkor is, ha ugyanazokat a génszakaszokat rekombinálják. A V(D)J rekombináció lehetővé teszi immunglobulinok és T-sejt receptorok létrehozását olyan antigénekre, amelyekkel sem a szervezetnek, sem az őse(i)nek nem kell korábban találkoznia, lehetővé téve az adaptív immunválaszt az újonnan kialakuló vagy gyakran változó kórokozókra (pl. szezonális influenza). Ennek a folyamatnak azonban az a fő kikötése, hogy a DNS-szekvenciának a keretben kell maradnia ahhoz, hogy a fehérje végtermékben megmaradjon a megfelelő aminosav-szekvencia. Ha a keletkező szekvencia a kereten kívül van, a sejt fejlődése leáll, és a sejt nem éli túl az érettséget. A V(D)J rekombináció ezért egy nagyon költséges folyamat, amelyet szigorúan szabályozni és ellenőrizni kell (és ez így is van).