Atât BR denaturat cât și nativ se poate lega de GroEL
Central pentru mecanismul activității GroEL este capacitatea sa de a recunoaște o gamă diversă de polipeptide, în principal prin interacțiuni între reziduurile hidrofobe ale substratului și elicele H și I de pe domeniile apicale GroEL (Fig. 1A) (Coyle et al. 1997). Aici, legarea atât a BR denaturat, cât și a BR nativ la GroEL a fost mai întâi examinată prin calorimetrie de titrare izotermă (ITC), deoarece fiecare stare are reziduuri de suprafață hidrofobe abundente care sunt ușor accesibile pentru GroEL. După cum se arată în Fig. 2A, titrarea lui GroEL cu BR produce termograme de titrare exotermice în ambele cazuri. Modificările termice se datorează în mod specific legării BR la GroEL, deoarece injectarea consecutivă de BR în tampoanele de analiză fără chaperonină produce termograme plate (Fig. suplimentară S1). Căldura din fiecare injecție prezentată în Fig. 2A a fost integrată, corectată cu căldura de diluție și a fost reprezentată grafic în funcție de raportul molar BR: GroEL (Fig. 2B). Schimbarea căldurii se potrivește unui set de modele de legare a siturilor (curbele roșii și albastre), rezultând o constantă de disociere (Kd) de aproape 0,3 nmol/L pentru BR denaturat și, respectiv, de aproape 6,0 nmol/L pentru BR nativ (Tabelul 1). Astfel, denaturarea BR a crescut afinitatea de legare a GroEL pentru această proteină membranară cu un ordin de mărime. Pe de altă parte, legarea oricăreia dintre probele de BR este determinată de o schimbare de entalpie favorabilă (ΔH) și opusă de o schimbare de entropie negativă (ΔS); stoichiometria de legare (N) determinată în ambele cazuri este apropiată de unitate (tabelul 1). Cu toate acestea, legarea BR-ului nativ este în mod clar mai puțin entalpică, cu o compensare entropică mai mică.
Legătura BR-ului cu GroEL evaluată prin ITC. A Titrarea lui GroEL cu BR denaturat SDS (dBR, roșu) sau BR nativ (nBR. albastru). Termogramele au fost înregistrate la 20 °C cu un instrument MicroCal ITC200. B Schimbul de căldură al fiecărei injecții din A a fost integrat și reprezentat grafic în funcție de raportul molar BR:GroEL. Liniile continue reprezintă ajustarea datelor la un model cu un singur set de situsuri (toate situsurile identice și echivalente), iar parametrii termodinamici obținuți sunt enumerați în tabelul 1
Cochaperonina GroES în formă de capac este o componentă esențială în plierea proteinelor mediată de GroEL în bacterii, și s-a demonstrat că împarte cu substratul aceleași situsuri de legare pe GroEL (Chen și Sigler 1999). Titrarea lui GroEL cu BR denaturat în prezența lui GroES indică faptul că GroES are un efect redus asupra legării BR (figura suplimentară S2 și tabelul 1). Acest rezultat poate fi înțeles dacă se ia în considerare Kd, care pentru formarea unui complex GroEL/ES a fost determinat anterior ca fiind de 3 μmol/L și este semnificativ mai mare decât cel al complexului BR-GroEL determinat aici (Behlke et al. 1997). Acest lucru indică o interacțiune mult mai slabă a celor două proteine chaperonine și, prin urmare, este în concordanță cu efectul nesemnificativ. Cu toate acestea, în prezența ATP, care reglează ciclurile de legare și eliberare a GroEL și GroES in vivo, afinitatea GroEL/ES ar crește cu trei ordine de mărime (în mod normal Kd ~1 nmol/L) (Farr et al. 2000), fiind teoretic capabilă să concureze cu legarea BR la GroEL. Efectul apoGroEL asupra pliajului BR și apoi rolul lui GroES și al ATP în acest proces au fost investigate ulterior.
Sistemul GroEL-GroES poate modula plierea BR în prezența DDM
S-a observat că o porțiune de BR denaturată prin SDS se pliază din nou atunci când este diluată cu un exces de detergent solubilizant n-dodecil-β-D-maltosid (DDM), așa cum a fost dezvăluit prin măsurarea recuperării absorbției retiniene (figura suplimentară S3) (Booth 1997). Nici o recuperare semnificativă nu a fost detectabilă în tamponul de analiză fără detergent sau suplimentat doar cu GroEL. Cu toate acestea, în prezența DDM, adăugarea de GroEL a arătat un efect evident asupra pliajului BR (Fig. suplimentară S3). Constanta de viteză pentru plierea mediată de GroEL (0,15 μmol/L), evaluată prin ajustarea cu o cinetică exponențială simplă, a fost estimată a fi ~ de două ori mai mică decât plierea spontană. Se știe că GroEL întârzie de obicei plierea proteinelor solubile care se pot plia eficient în absența sa. Acest lucru a fost explicat printr-o competiție între plierea intramoleculară și legarea intermoleculară la GroEL (Gray și Fersht 1993; Itzhaki și colab. 1995). Pare întru totul plauzibil ca GroEL să se comporte în mod similar în replierea BR denaturate. Atunci când concentrația de GroEL a fost crescută la 0,30 μmol/L, constanta de viteză estimată nu s-a schimbat în mod evident, în timp ce randamentul de pliere a atins un nivel mult mai mare decât plierea spontană după 60 de minute (Fig. suplimentară S3). Aceste date demonstrează că apoGroEL poate scădea rata de pliere a BR, dar crește randamentul proteinei pliate.
Pentru că celulele bacteriene conțin mai mulți milimoli de ATP și, în condiții normale, raportul molar relativ dintre GroES și GroEL este de 1,9, iar după șocul termic de 4,7 (Moparthi et al. 2013); este puțin probabil ca GroEL să rămână mult timp fără să se lege de ATP și GroES. În prezența ATP (albastru în Fig. 3A), recuperarea BR pliate corect a fost semnificativ mai rapidă și mai mare în comparație cu cea cu apoGroEL singur sau cu procesul spontan (roșu și negru în Fig. 3A). În schimb, combinația dintre GroEL și GroES a avut un efect redus asupra vitezei de pliere spontană, dar a redus într-o oarecare măsură randamentul (Fig. 3A, cyan). Acest lucru indică o interacțiune între GroEL și GroES fără a necesita ATP, probabil indusă de BR legat de GroEL, care, la rândul său, a avut un efect negativ asupra recuperării proteinei pliate corect. Atunci când a fost utilizat sistemul complet de chaperonine (Fig. 3A, verde), s-a observat o creștere maximă a vitezei, dar randamentul de pliere a căzut între cele două cazuri precedente.
Cursul în timp al plierii BR modulat de sistemul GroEL-GroES dependent de ATP. A Recuperarea BR pliate a fost monitorizată continuu cu absorbția la 554 nm. S-au făcut următoarele adăugiri: niciunul (negru); 0,3 μmol/L GroEL (roșu); 0,3 μmol/L GroEL și 5 mmol/L ATP (albastru); 0,3 μmol/L GroEL și 0,6 μmol/L GroES (cyan); 0,3 μmol/L GroEL, 0,6 μmol/L GroES și 5 mmol/L ATP (verde). B Plierea BR mediată de GroEL net a fost efectuată mai întâi; apoi, la T = 60 min, proba a fost suplimentată doar cu ATP, doar cu GroES sau cu ambele, după cum este indicat. C Pentru comparație cu A, a fost analizat, de asemenea, efectul versiunii fără ciclu cu un singur inel (SR1) a GroEL asupra pliajului BR. Concentrațiile de SR1, GroES și ATP utilizate au fost de 0,6 μmol/L, 1,2 μmol/L și, respectiv, 5 mmol/L. D Efectele GroEL/ES plus ATP asupra pliajului nativ al BR au fost examinate prin urmărirea modificării absorbției la 560 nm. Concentrațiile de chaperonină și nucleotidă utilizate în B și D au fost aceleași ca în A. BR a fost menținută la 2,4 μmol/L în toate experimentele. Liniile albastre și verzi din A și linia albastră din C reprezintă ajustarea datelor la ecuația exponențială trifazică, în timp ce restul liniilor reprezintă ajustarea cu ecuația exponențială simplă. Toate liniile din B și D sunt simple ghiduri pentru ochi
Rezultatele de mai sus indică faptul că ATP și GroES pot influența plierea BR mediată de GroEL într-un mod diferit. Legarea GroES la GroEL este oarecum dăunătoare pentru pliere, în contrast cu rolul pozitiv bine cunoscut al încapsulării substratului în cușca GroEL/ES pentru plierea asistată (Jewett și Shea 2010). Ne-am întrebat apoi cum a fost produs acest efect negativ. În mod curios, GroES singur sau secvența sa de buclă mobilă prin care GroES se leagă de GroEL a facilitat, de asemenea, recuperarea BR pliate (figura suplimentară S4). Mai mult, secvența în buclă a prezentat un efect similar cu GroES în plierea mediată de GroEL în absența și în prezența ATP (Fig. suplimentară S4). Deși nu poate forma un capac sigilat deasupra cavității centrale GroEL ca GroES, ceea ce implică o contribuție semnificativă a interacțiunii buclă-GroEL la pliere. În mod notabil, reziduurile hidrofobe de pe suprafața apicală a GroEL implicate în legarea buclei mobile GroES se suprapun în cea mai mare parte cu cele implicate în legarea proteinei substrat (Motojima et al. 2000). Este puțin probabil ca BR hidrofobă să fi fost deplasată și eliberată în cușca hidrofilă GroEL/ES de către bucla mobilă, mai ales având în vedere prezența micelilor DDM în afara cuștii, ceea ce ar favoriza și mai mult plierea sau solubilizarea BR. De preferință, așa cum s-a demonstrat pentru plierea asistată a mai multor proteine solubile (Motojima și Yoshida 2010), BR poate fi capturată în apropierea interfeței GroEL/ES, ieșind parțial în exterior atunci când în acest studiu s-a utilizat întregul sistem sau chiar numai GroEL/ES. O astfel de interacțiune poate împiedica BR să acceseze miclele DDM favorabile, rezultând astfel randamentul redus de pliere observat atât cu GroES, cât și cu bucla sa mobilă.
Cu toate acestea, unele studii sugerează că rolul ATP și al GroES este doar de a disocia substraturile lipicioase (adică cu un Kd în regiunea nmol/L determinată aici), care limitează rata de pliere asistată sau chiar inhibă activitatea de pliere a GroEL dacă nu sunt eliminate (Priya et al. 2013). Pentru a testa dacă GroES și ATP prezintă un efect similar în plierea asistată a BR, am incubat mai întâi apoGroEL cu BR denaturat timp de 60 de minute; apoi, am adăugat GroEL sau/și ATP (Fig. 3B). Adăugarea ulterioară a oricăreia dintre componente a promovat și mai mult plierea BR, dar a fost mai puțin eficientă decât adăugarea simultană a ambelor componente, demonstrând sinergismul dintre cele două pentru a ajuta la plierea mediată de GroEL. Măsurătorile de anizotropie cu peptide transmembranare BR, care au fost utilizate ca mimetice pentru BR denaturat pentru a ocoli complicațiile introduse de natura dinamică a BR denaturat și a interacțiunilor GroEL-BR, au arătat că numai combinația de ATP și GroES a fost capabilă să separe eficient complexul peptidic-GroEL preformat (fig. suplimentară S5). Astfel, se pare că atât GroES cât și ATP sunt necesare pentru a disocia conformerii BR de înaltă afinitate și pentru a regenera situsurile de legare (sau catalitice) blocate de GroEL.
Pentru a examina în continuare efectul lui GroES și ATP asupra pliajului BR mediat de GroEL, am folosit un mutant GroEL cu un singur inel (SR1) care formează un complex stabil cu GroES (Weissman et al. 1995), spre deosebire de sistemul ciclic GroEL-GroES. Similar observației noastre cu GroEL, ATP a crescut rata și randamentul pliajului mediat de SR1 (albastru în Fig. 3C), în timp ce prezența lui GroES a redus considerabil ambele aspecte (cyan) în comparație cu cazul cu apoSR1 singur sau cu procesul spontan (roșu sau negru). Deoarece s-a determinat prin ITC că BR denaturat se leagă de SR1 cu o stoichiometrie apropiată de unitate (fig. suplimentară S2), iar SR1 utilizat a fost de două ori mai mare decât concentrația de GroEL, speculăm că s-au format mai mulți complecși BR-SR1 decât BR-GroEL, prin care GroES a exercitat o influență mai mare asupra pliajului (cyan). După cum era de așteptat, adăugarea atât a ATP, cât și a GroES a arătat un efect nesemnificativ asupra recuperării BR (verde), atribuibil legăturii ireversibile a GroES la SR1 în prezența ATP (Weissman și colab. 1995). Mai mult decât atât, acest rezultat indică faptul că intensificarea maximă a vitezei observată cu GroEL se datorează ciclurilor multiple de legare și eliberare a lui GroES reglementate de ATP.
GroEL singur sau în combinație cu ATP sau/și GroES a arătat o influență neglijabilă asupra structurii BR nativ solubilizat cu DDM (Fig. 3D), indicând o interacțiune intramoleculară mai puternică în cadrul proteinei native decât legarea intermoleculară la GroEL. Astfel, tranziția BR mediată de chaperonină de la starea denaturată metastabilă la starea nativă este favorabilă din punct de vedere termodinamic.
Evidențe atât pentru dezagregarea cât și pentru desfășurarea mediată de chaperonină
Măsurarea pliajului spontan al BR la concentrații variate demonstrează că agregarea a dus la o recuperare doar parțială a BR pliate corect, iar rata aparentă a fost independentă de concentrație, ceea ce implică faptul că agregarea a fost ireversibilă (Fig. suplimentară S6). În absența detergentului solubilizator DDM, s-a estimat că BR denaturată prin SDS, prin spectroscopie de corelație a fluorescenței (FCS), are un coeficient de difuzie (~67 μm2/s) mult mai mic decât cea legată la GroEL (~104 μm2/s) (Fig. 4). Acest lucru reflectă faptul că agregatele formate de BR denaturat sunt chiar mai mari decât complexul BR-GroEL cu o stoichiometrie de legare apropiată de unitate, așa cum a fost determinată prin ITC. Acest lucru înseamnă, de asemenea, că GroEL a fost capabil să întrerupă structura de agregare, pompând în mod esențial calea de pliere productivă cu BR monomerică. Mai mult, s-a determinat că nBR solubilizat cu DDM are un coeficient de difuzie de ~117 μm2/s, care este mai mare decât cel al dBR cu GroEL și mult mai mare decât cel al dBR singur (Fig. 4). Acest lucru sugerează că nBR a fost bine dispersat în prezența DDM și susține, de asemenea, ideea dezagregării dBR mediată de GroEL. În plus, atunci când sistemul complet de chaperonine a fost adăugat în BR denaturat, precipitații floculente albe au fost imediat vizibile (datele nu sunt prezentate), indicând desfășurarea forțată, precum și sinergismul dintre GroES și ATP în acest aspect. Fără detergenți solubilizatori sau lipide care să imite membranele biologice în soluția de masă, BR desfășurată s-ar agrega și precipita instantaneu, în contrast cu creșterea semnificativă a vitezei de pliere observată în prezența DDM.
Măsurarea FCS a BR denaturată în absența sau în prezența GroEL în comparație cu BR nativă. Amplitudinile de autocorelație a fluorescenței G(τ) a fluorescenței Alexa Fluor 488 au fost prezentate pentru BR denaturat cu SDS singur sau cu un exces de GroEL în absența detergentului solubilizator sau BR nativ solubilizat cu DDM. Coeficienții de difuzie (D) au fost obținuți prin ajustarea curbei de autocorelație cu Ecuația 1. Abaterile standard au fost obținute din trei măsurători independente
Inserția membranară a BR mediată de GroEL-GroES
Pentru a determina dacă sau în ce mod GroEL-GroES ar susține integrarea BR în bistrat, s-au preparat vezicule membranare citoplasmatice inversate (IMVs) din Escherichia. coli și amestecate cu BR denaturat în prezența și absența apoGroEL, sau plus ATP/GroES (Fig. 5A). ApoGroEL a provocat o schimbare nesemnificativă în recuperarea BR pliate corect în IMVs, așa cum a fost măsurată prin spectroscopie UV-Vis (negru și roșu). Spre deosebire de replierea în miceliile DDM, adăugarea de GroEL și ATP s-a dovedit a fi în detrimentul inserției membranare (albastru), în timp ce GroEL combinat cu GroES a facilitat acest proces (cyan). Motivul real al acestei diferențe reproductibile nu este cunoscut, dar rigiditatea IMV-urilor și modificarea structurală a BR legate de GroEL indusă de legarea ATP sau GroES ar putea fi motive posibile. În mod specific, se știe că legarea ATP de către GroEL determină o extindere a deschiderii către cavitatea chaperoninei (Skjaerven et al. 2015). Această modificare este mai apreciabilă decât cea cauzată de simpla legare a GroES la GroEL (Kim et al. 2005), permițând astfel, eventual, desfășurarea substratului legat (Lin et al. 2008; Sharma et al. 2008), favorabilă unei pliaje productive într-un solvent adecvat. Cu toate acestea, spre deosebire de micela DDM, care este foarte dinamică, IMVs a fost probabil incapabilă să protejeze prompt speciile BR desfășurate și să ofere în timp util un micro-mediu de pliere avantajos. În comparație, asocierea slabă a GroES cu GroEL în absența ATP ar putea livra BR la IMV-urile pregătite într-un mod mai eficient. Cu toate acestea, similar cu replierea în miceliile DDM, sistemul complet GroEL-GroES a îmbunătățit foarte mult inserția membranară a BR (verde), care a atins rapid o stare de echilibru, cantitatea de BR recuperată încadrându-se între cele două cazuri precedente.
Inserția BR în IMV-uri mediată de sistemul GroEL-GroES. A Inserția și/sau replierea BR denaturat (2,4 μmol/L) în IMVs au fost monitorizate continuu cu absorbția la 554 nm. S-au făcut următoarele adăugiri: niciunul (negru); 0,3 μmol/L GroEL (roșu); 0,3 μmol/L GroEL și 5 mmol/L ATP (albastru); 0,3 μmol/L GroEL și 0,6 μmol/L GroES (cyan); 0,3 μmol/L GroEL, 0,6 μmol/L GroES și 5 mmol/L ATP (verde). B BR nativ poate fi transferat în mod eficient la IMVs în prezența GroEL cu ajutorul ATP și GroES. Concentrațiile testate de BR nativ, GroEL, GroES și ATP au fost de 0,4, 5, 10 μmol/L și, respectiv, 5 mmol/L
În continuare, anizotropia fluorescenței a fost utilizată pentru a sonda efectele chaperoninelor bacteriene asupra inserției BR în IMVs (Fig. 5B). Atunci când BR nativ marcat fluorescent a fost amestecat cu o cantitate excesivă de GroEL, anizotropia s-a deplasat la o valoare mai mare, demonstrând că proteina membranară a format un complex stabil cu chaperonina. Este important faptul că adăugarea ulterioară de IMV a dus la o creștere suplimentară a anizotropiei, ceea ce indică integrarea BR în IMV. S-a constatat că ATP și GroES îmbunătățesc și mai mult transferul BR în membrană, după cum o arată și creșterea anizotropiei. Aceste rezultate ridică perspectiva ca GroEL, împreună cu GroES și ATP, să aibă un rol direct în integrarea proteinelor în bistratul lipidic in vivo.
.