Abstract
Glicogen fosforilază este o enzimă importantă pentru metabolismul carbohidraților în mușchi. Aceasta utilizează fosfatul anorganic pentru a elimina glucoza din glicogen, producând glucoză-1-fosfat, care poate fi utilizat pentru producerea de ATP. Fosforilaza glicogenului inactivă (fosforilază h) este activată fie prin legarea alosterică a 5′-AMP, fie prin fosforilarea de către fosforilază kinaza (PhK). Fosforilarea produce fosforilază a, care este activă în absența AMP. PhK este singura kinază care poate fosforila fosforilaza b, care, la rândul său, este singurul substrat pentru PhK. Această teză de doctorat a încercat să determine motivele acestei specificități și modul în care aceste două enzime se recunosc una pe cealaltă, studiind mutanți ai fosforilazei glicogenului care au fost direcționați în funcție de situs; toți mutanții au fost testați pentru a determina modificările în interacțiunea lor cu o formă trunchiată a subunității catalitice a fosforilazei kinazei, gamma(1–300). Trei mutații (R69K, R69E și E501A), efectuate în locuri care interacționează cu terminația amino-terminală fie în fosforilaza b, fie în cea a, au prezentat puține diferențe în ceea ce privește fosforilarea de către gamma(1–300) în comparație cu fosforilaza b. Cu toate acestea, cinci mutații, efectuate la trei situsuri din coada amino-terminală a fosforilazei (K11A, K11E, I13G, R16A și R16E), au produs scăderi ale eficienței catalitice pentru gamma(1–300), în comparație cu fosforilaza b. R16E a fost cel mai slab substrat pentru gamma(1–300), dând o scădere de 47 de ori a eficienței catalitice. Terminația amino-terminală, și în special Arg 16, sunt factori foarte importanți pentru recunoașterea fosforilazei de către gamma(1–300). În plus, I13G și R16A au putut fi fosforilate de proteinkinaza A, care nu recunoaște fosforilaza nativă;S-a observat, de asemenea, că unii dintre mutanți au avut stări conformaționale modificate. R16A și R16E au fost activate la o concentrație foarte mică de AMP și au cristalizat la temperaturi scăzute, ca și fosforilaza a. Acest lucru indică faptul că, chiar și fără fosforilare, structurile lor se aseamănă mai mult cu fosforilaza a decât cu fosforilaza b. Alți doi mutanți au produs efectul opus, comportându-se ca fosforilaza b după fosforilare. R69E a fost activat doar parțial prin fosforilare, iar I13G a fost complet inactiv după fosforilare. I13G a fost prima observație a unei forme de fosforilază care nu a putut fi activată prin fosforilare.
.