Isolamento e identificazione dei volatili
Il naso umano percepisce molti VOC come odori e questi odori sono spesso la nostra prima indicazione della presenza di muffe. La caratterizzazione chimica (isolamento, separazione, identificazione e quantificazione) dei VOC, tuttavia, richiede metodi analitici specializzati, dissimili dagli approcci utilizzati nella chimica tradizionale “umida”. I progressi tecnologici della fine del XX e dell’inizio del XXI secolo hanno migliorato la nostra capacità di rilevare i volatili in modo preciso, accurato e a basse concentrazioni (Zhang e Li, 2010; Hung et al., 2015). In breve, i metodi tradizionali prevedono la distillazione a vapore e l’estrazione liquido-liquido, seguita dalla concentrazione e dalla verifica chimica dei singoli composti. Alcuni dei primi studi sulla natura chimica dei COV sono stati fatti utilizzando estratti di cloruro di metilene che sono stati concentrati mediante distillazione a vapore e analizzati mediante cromatografia gas-liquido e spettrometria di massa (MS). In un primo studio utilizzando questo approccio, sono stati analizzati i VOC di Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus oryzae, e Aspergillus parasiticus. Tutte e quattro le specie hanno prodotto 3-metilbutanolo, 3-ottanone, 3-ottanolo, 1-octen-3-olo, 1-octenolo e 2-octen-1-olo. Per A. niger, oltre il 90% della miscela di COV identificata consisteva in 1-octen-3-olo, che è il composto odoroso che dà ai funghi il loro odore caratteristico. Per A. parasiticus, l’1-octen-3-olo era il 35,6% della miscela volatile totale, mentre il relativo composto a otto carboni, il 2-octen-1-olo, che ha uno sgradevole odore di mosto-olio, costituiva il 34,8% (Kamiński et al., 1974).
I metodi si sono poi basati sulla gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS), che combina la separazione cromatografica, l’identificazione tramite spettri di massa e ritenzione cromatografica e la quantificazione dei campioni volatili. I VOC nello spazio di testa delle colture fungine sono di solito raccolti da materiali solidi di assorbimento, come il carbone attivo o una fibra. Ogni metodo di raccolta ha delle distorsioni innate e può consentire la formazione di artefatti; in generale, i composti non polari sono raccolti preferibilmente rispetto a quelli polari. La gascromatografia può anche introdurre errori in quanto a volte è difficile separare due composti l’uno dall’altro, con conseguente loro confluenza. Questo è stato notato nel caso del 2-metil-1-butanolo e del 3-metil-1-butanolo, isomeri che differiscono solo per la trasposizione di un gruppo metile (Börjesson et al., 1992). Altri svantaggi dell’analisi GC-MS includono la necessità di operatori qualificati, il suo costo relativo e il fatto che non è efficace con i COV più reattivi (Elke et al., 1999; Gao et al., 2002; Gao e Martin, 2002; Rappert e Müller, 2005).
La microestrazione in fase solida (SPME) è un metodo popolare e portatile. I COV sono prima assorbiti e concentrati su una fibra, e poi successivamente consegnati al rivelatore dove il desorbimento avviene nell’iniettore del GC stesso. La SPME è adatta per prelevare campioni ambientali che vengono poi trasportati in laboratorio per l’identificazione. Accoppiata a GC-MS, è un mezzo conveniente e ampiamente utilizzato per identificare qualitativamente i VOC da colture microbiche o da edifici contaminati (Fiedler et al., 2001; Wady et al., 2003; Jeleń e Grabarkiewicz-Szczesna, 2005). La SPME è spesso l’approccio migliore per determinare la quantità relativa di un composto volatile target in una situazione esplorativa, o per processi di campionamento ripetitivi. Tuttavia, non è utile per l’identificazione di nuovi composti.
Sono stati sviluppati molti metodi analitici specializzati che integrano i classici approcci GC-MS e possono essere utili per analisi mirate. Per esempio, la reazione di trasferimento protonico-spettrometria di massa (PTR-MS) è utile per prendere campioni rapidi e per rilevare basse concentrazioni (Kamysek et al., 2011; Schwoebel et al., 2011). Questo metodo è stato impiegato nelle scienze ambientali, nella tecnologia alimentare e nella diagnosi medica (Gasperi et al., 2001; Cappellin et al, 2013).
Utilizzando il desorbimento termico (TD)-gas cromatografia/spettroscopia di massa, il profilo dei metaboliti volatili in vitro di Aspergillus fumigatus è stato caratterizzato indicando una firma distintiva contenente i monoterpeni canfene, α- e β-pinene, e limonene; e i composti sesquiterpenici α- e β-trans-bergamotene (Koo et al, 2014).
La spettrometria di massa con tubo a flusso ionico selezionato (SIFT-MS) ha la capacità di rilevare COV microbici con velocità e sensibilità in una miscela di gas moderatamente complessa. È in grado di puntare ai COV a basse concentrazioni parte per miliardo e può misurare alcuni composti nell’intervallo parte per trilione. In questa tecnica, i COV totali sono ionizzati all’interno di un tubo di flusso, senza richiedere la separazione cromatografica (Syhre et al., 2008; Chambers et al., 2011). Il metodo è stato utilizzato per quantificare i COV emessi da A. fumigatus in cocoltura con batteri che si trovano spesso nei polmoni umani malati. Le colture con A. fumigatus hanno prodotto quantità “copiose” di ammoniaca e i composti organosolforati metanethiol (noto anche come metil mercaptan), dimetilsolfuro e dimetilsolfuro (Chippendale et al., 2014).
L’estrazione per distillazione simultanea (SDE) comprende una breve fibra di silice coperta di materiale organico come fase stazionaria per concentrare i COV che vengono poi desorbiti in un iniettore caldo. La SDE è stata usata per determinare i componenti volatili nelle analisi ambientali, alimentari, forensi, petrolifere, farmaceutiche e dei polimeri per ottenere campioni più concentrati (Orav et al., 1996). Per esempio, alcuni composti di sapore sono stati studiati usando una combinazione di SDE e SPME. I composti di sapore possono essere analizzati quantitativamente dalla SDE mentre la SPME è usata per uno screening semplice, rapido e di routine (Cai et al., 2001).
Lo spettrometro di mobilità a colonna multipla (MCC-IMS) ha una sensibilità dell’ordine della parte per trilione, alta velocità e richiede una bassa conoscenza tecnica. I metaboliti caratteristici delle specie A. fumigatus e Candida sono stati differenziati nell’analisi dello spazio di testa con questo approccio (Perl et al., 2011).
I nasi elettronici (e-nos) traducono i volatili in segnali elettrici basati sull’interazione con superfici elettroniche e possono essere utilizzati per rilevare composti noti. Gli e-nasi sono composti da un gruppo di sensori chimici con diverse selettività, un’unità di pre-elaborazione del segnale e un sistema di distinzione del modello (Gardner e Bartlett, 1994). Diversi COV formano un’impronta caratteristica che può essere distinta da confronti con modelli precedentemente registrati nel sistema di riconoscimento. L’applicazione medica degli e-nasi si è originariamente concentrata su patogeni batterici o malattie non infettive come il cancro ai polmoni, la malattia polmonare ostruttiva cronica e l’asma (Valera et al., 2012). A seconda dell’applicazione, i campioni di COV da tamponi, espettorato, siero, feci, respiro o urina sono utilizzati per scopi diagnostici. I campioni di respiro sono stati utilizzati per il rilevamento precoce dell’aspergillosi (de Heer et al., 2013).
Sono ancora molte le sfide tecniche nel lavoro con i VOC fungini, ed è spesso difficile confrontare i risultati ottenuti tra diversi laboratori. La stessa specie fungina può avere diversi profili VOC basati su fattori ambientali e genetici sconosciuti o non controllati. Inoltre, il protocollo sperimentale utilizzato può influenzare drasticamente il profilo VOC. Per esempio, nel lavoro su Aspergillus flavus, de Lucca et al. (2010) hanno rilevato solo un terpene utilizzando SPME per raccogliere i volatili prima di sottoporli a GC-MS. Successivamente, utilizzando un concentratore di campioni prima di sottoporli a un diverso modello di strumento GC-MS, il gruppo è stato in grado di discernere diversi terpeni (de Lucca et al., 2012). Il metodo di manipolazione dei materiali prima della sperimentazione può provocare artefatti e l’autoclave può causare la formazione di volatili non biogenici (Börjesson et al., 1992). Poiché i dati sono spesso incoerenti tra le prove, alcuni autori hanno messo in dubbio la riproducibilità delle emissioni microbiche di VOC (Schleibinger et al., 2002). Il lavoro futuro con i COV fungini deve essere consapevole dei molti fattori che possono influenzare i risultati. Sarebbe utile se le linee guida per le migliori pratiche fossero sviluppate dalla comunità di scienziati che studiano i VOC fungini.