10x Genomics Blog

Si nuota in un mare di cellule: Perché la genomica delle singole cellule?

I sistemi biologici complessi sono il risultato della funzione coordinata di singole cellule che eseguono una “danza” intricata, ognuna delle quali contribuisce con il proprio ruolo speciale all’insieme. A causa di questa complessità, la ricerca sull’espressione genica in organismi, tessuti o popolazioni di cellule è spesso limitata dall’uso di metodi tradizionali di RNA-seq. Come scienziati, capiamo intuitivamente che quando “maciniamo e troviamo” per eseguire esperimenti sulla nostra miscela diluita di RNA, stiamo davvero ottenendo solo una piccola idea di ciò che potrebbe accadere nelle nostre cellule di interesse: le differenze da cellula a cellula vengono perse e l’eterogeneità cellulare può essere completamente mascherata. Infatti, l’analisi dell’espressione dell’RNA di massa spesso descrive uno stato dedotto in cui nessuna (o molto poche) delle cellule esiste realmente!

Forse sei un neuroscienziato che lavora nel cervello di topo, studiando lo sviluppo di una sottopopolazione di neuroni che producono un neurotrasmettitore specifico. Se solo poteste isolare quella popolazione e analizzarla cellula per cellula, le potenziali intuizioni sarebbero davvero stimolanti per i neuroni! Allo stesso modo nel caso della ricerca sul cancro: come si fa a distinguere meglio l’espressione genica e, forse più importante, l’eterogeneità cellulare, in un tumore? E se si potessero confrontare non solo le differenze inter-tumorali, ma anche quelle intra-tumorali ed esplorare le popolazioni di cellule immunitarie legate al microambiente tumorale? Questa diversità, spesso oscurata dai metodi di RNA-seq in blocco, può essere rivelata utilizzando l’RNA-seq di singole cellule per esplorare specificamente queste popolazioni di cellule clinicamente significative. Gli esempi di svantaggi dell’analisi di massa sono abbondanti, e sezionare le differenze di tipo cellulare nella maggior parte, se non in tutti, di questi complessi sistemi biologici è fondamentale per la nostra comprensione dei loro contributi, soprattutto durante lo sviluppo e nella progressione della malattia.

Come facciamo a isolare e analizzare le singole cellule?

La tecnologia RNA-seq su singola cellula (scRNA-seq) di 10x Genomics, la soluzione Chromium™ Single Cell 3′, permette di analizzare i trascrittomi su base cellulare attraverso l’uso del partizionamento microfluidico per catturare singole cellule e preparare librerie di cDNA con codice a barre e sequenziamento di prossima generazione (NGS). In particolare, singole cellule, trascrizione inversa (RT) reagenti, Gel Beads contenenti oligonucleotidi codificati a barre, e olio sono combinati su un chip microfluidico per formare vescicole di reazione chiamato Gel Beads in emulsione, o GEMs. I GEM si formano in parallelo all’interno dei canali microfluidici del chip, consentendo all’utente di elaborare da 100 a 10.000 cellule singole in una singola corsa di 7 minuti dello strumento Chromium™. È importante notare che le cellule sono caricate ad una diluizione limitante per massimizzare il numero di GEM contenenti una singola cellula per garantire un basso tasso di doppietta, pur mantenendo un alto tasso di recupero delle cellule fino a ~ 65%.

Ogni GEM funzionale contiene una singola cellula, una singola Gel Bead e reagenti RT. All’interno di ogni vescicola di reazione GEM, una singola cellula viene lisata, il Gel Bead viene sciolto per liberare gli oligonucleotidi RT identicamente codificati a barre in soluzione, e la trascrizione inversa di mRNA poliadenilato si verifica. Di conseguenza, tutti i cDNA di una singola cellula avranno lo stesso codice a barre, permettendo alle letture di sequenziamento di essere ricondotte alle loro singole cellule originali di origine. La preparazione di librerie NGS da questi cDNA con codice a barre viene poi effettuata in una reazione di massa altamente efficiente. Il video qui sotto fornisce una grande spiegazione visiva di come funziona il tutto.

Dalla preparazione del campione ai video how-to: Link utili per iniziare

Il flusso di lavoro Chromium Single Cell 3′ inizia con le tue cellule di interesse seguito dalla costruzione della libreria NGS utilizzando i nostri kit di reagenti e il Chromium Controller. La preparazione della tua libreria di cDNA con codice a barre (come descritto in generale nel video sopra) è un passo importante e fedele al detto “garbage in, garbage out” – preparare sospensioni cellulari di alta qualità è la chiave per ottenere il massimo dai tuoi dati RNA-seq. Se hai bisogno di assistenza con il processo di preparazione delle cellule, abbiamo più protocolli dimostrati disponibili sul nostro sito web come la dissociazione del tessuto neurale o la preparazione di sospensioni di protoplasti di muschio per l’uso in scRNA-seq, con più protocolli aggiunti regolarmente sul nostro sito web di supporto. Per una guida e raccomandazioni su come preparare al meglio i vostri campioni una volta che sono in sospensione, un buon punto di partenza è la nostra guida alla preparazione di singole cellule, dove si può imparare di più sulle migliori pratiche e visualizzare un protocollo generale. Se sei più di un allievo visivo, il nostro how-to-video, in particolare i capitoli da 4 a 7, dovrebbe aiutarti a camminare attraverso il processo di preparazione del campione e della libreria.

• Guida alla preparazione di singole cellule

• Protocolli dimostrati

• Come-a-video

• Chromium™ Controller

• Guide per l’utente

• Come-to-video

• Software Cell Ranger™

• Loupe™ Cell Browser

• How-to-videos

Analisi dei dati, una cellula alla volta

Dopo aver preparato la tua libreria, il sequenziamento viene eseguito utilizzando gli strumenti di sequenziamento Illumina®. Questo porta alla parte divertente: ricavare intuizioni biologiche dai dati RNA-seq di una singola cellula! La (potenzialmente) enorme quantità di dati generati dalla soluzione Chromium Single Cell 3′ può essere facilmente gestita dal nostro software e dagli strumenti di visualizzazione che sono stati progettati per togliere un sacco di congetture – il software Cell Ranger™ trasforma i dati di sequenziamento con codice a barre in file pronti per l’analisi dell’espressione della singola cellula, e la visualizzazione viene effettuata tramite il browser delle cellule Loupe™. Se vuoi un tutorial passo dopo passo sull’uso del nostro software, i capitoli da 8 a 11 dei nostri video su come coprire tutto, dal conteggio delle trascrizioni con il software Cell Ranger alla splendida visualizzazione dei dati con Loupe Cell Browser. C’è anche un numero crescente di strumenti di analisi delle singole cellule sviluppati dalla comunità, tra cui Seurat, Monocle e Cell View. Leggi di più su questi strumenti di analisi e altri articoli sulle cellule singole sul blog di 10x Genomics, dove evidenziamo importanti contributi di ricerca, forniamo suggerimenti e trucchi e ti teniamo aggiornato su tutte le cose sulle cellule singole!

Se hai altre domande o dubbi su come iniziare con la soluzione Chromium Single Cell 3′, sentiti libero di lasciare un commento qui o contattaci direttamente. Che si tratti di tracciare lo sviluppo degli organoidi cerebrali, studiare il trapianto di midollo osseo in pazienti con leucemia mieloide acuta, o svelare un nuovo percorso per l’autorinnovamento delle cellule staminali intestinali, il numero di pubblicazioni di Chromium Single Cell cresce ogni giorno, e non vediamo l’ora di sentire tutte le vostre incredibili ricerche!