Analisi e quantificazione della fusione dei mioblasti in vitro usando la macchia multipla LADD

Il tessuto muscolare scheletrico adulto contiene una popolazione di cellule precursori, note come cellule satellite, che sono responsabili della riparazione del muscolo scheletrico (1-3). Le cellule satelliti attivate (mioblasti) migrano verso il sito del trauma muscolare, dove proliferano, si differenziano e si fondono in miotubi multinucleati (3-5). Il successo finale di questo processo è misurato dal grado di fusione dei mioblasti residenti durante la differenziazione terminale.

Per valutare sperimentalmente la fusione dei mioblasti in vitro, viene calcolato un indice di fusione basato sulla rilevazione di immunofluorescenza al microscopio. Anticorpi marcati in fluorescenza sono utilizzati per rilevare le proteine strutturali delle fibre muscolari come la catena pesante della miosina (MyHC) e la desmina, o in alternativa, la falloidina marcata in modo fluorescente può essere utilizzata per visualizzare la F-actina (6-9). I nuclei sono marcati in modo fluorescente usando un composto legante il DNA come Hoechst 33258. Successivamente, sia la percentuale di nuclei in miociti con ≤ 3 nuclei (9) o la percentuale di nuclei in MyHC-positivi miotubi (10) è calcolato. Questi approcci sono ben stabiliti, tuttavia, richiedono ampia, lunga ottimizzazione per generare un segnale forte e specifico per l’antigene di interesse e successiva analisi di fusione. Se vengono utilizzati anticorpi marcati con fluorescenza, l’accesso a un microscopio a fluorescenza è un ulteriore requisito non disponibile in tutte le istituzioni. La successiva quantificazione richiede un’analisi laboriosa e lunga di numerosi campi di vista per ottenere un indice di fusione rappresentativo della popolazione. Queste limitazioni, insieme con la spesa relativa di test basati su anticorpi, ci ha spinto a sviluppare un rapido, conveniente in vitro test per la quantificazione della fusione dei mioblasti utilizzando il ampiamente disponibile LADD Multiple Stain.

Il LADD Multiple Stain (11) è una macchia combinata nucleare e citoplasmatica che contiene fucsina e blu toluidina (Cat. # 70955; LADD Research Industries, Williston, VT). Per i nostri studi, LADD fresco è preparato per contenere 0,365 g di blu di toluidina (Cat. #89640-5G; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e 0,135 g di fucsina (Cat. #47860-25G; Sigma- Aldrich) in un volume finale di 50 ml di etanolo al 30%. La soluzione viene mescolata fino a dissoluzione e poi filtrata attraverso carta da filtro Whatman (numero 4) (Cat. #09-825B, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Il colorante LADD può essere conservato in un contenitore di plastica o di vetro a temperatura ambiente e può essere riutilizzato. Le cellule da colorare vengono lavate con soluzione salina a base di fosfato (PBS) e fissate in etanolo al 70% per 10 minuti. L’etanolo viene rimosso e vengono aggiunti 500 µL di colorante LADD, assicurando una copertura completa delle cellule. Le cellule vengono incubate per 1 minuto, dopodiché la macchia viene rimossa, e le cellule vengono ripetutamente lavate con acqua distillata fino a quando il LADD cessa di filtrare nell’acqua. Le cellule vengono poi lasciate asciugare e conservate a temperatura ambiente fino alla visualizzazione con la microscopia a contrasto di fase. Per migliorare l’illuminazione durante la visualizzazione, le cellule colorate possono essere immersi in PBS.

Per determinare se questa macchia può essere utilizzato con successo per visualizzare la fusione dei mioblasti, le cellule C2C12 sono stati coltivati fino al 80% di confluenza (Figura 1A) in condizioni di cultura standard (12). I media è stato poi cambiato in media differenziazione contenente 2% di siero di cavallo, con conseguente fusione in miotubi (Figura 1B). Differenziazione successo è stato confermato da una maggiore espressione di MyHC (Figura 1D) rispetto alle cellule indifferenziate (Figura 1C). Dopo la colorazione LADD, i mioblasti indifferenziati C2C12 visualizzare un citoplasma viola chiaro e un nucleo più scuro (Figura 1E; freccia). Tuttavia, dopo la differenziazione, il citoplasma dei mioblasti appare viola scuro (Figura 1F; punte di freccia), mentre i nuclei più chiari sono chiaramente visibili all’interno della cellula multinucleata (Figura 1F; freccia). Pertanto, dopo LADD macchia multipla, nuclei chiaramente definiti sono osservati e sono facilmente distinguibili dal citoplasma del miotubo multinucleato (Figura 1F) come visto utilizzando la microscopia a fluorescenza dopo immunocitochimica (Figura 1D).

Per determinare se l’analisi delle immagini potrebbe essere utilizzata per misurare il progresso della fusione dei mioblasti, le cellule C2C12 sono state differenziate per 6 giorni, e le immagini delle cellule colorate con LADD prese a 200 × ingrandimento utilizzando un microscopio ottico invertito Olympus CKX41 (Olympus Corporation, Tokyo, Giappone). Come previsto, il numero di miociti e miotubi di fusione chiaramente aumentato ad ogni giorno successivo differenziazione (Figura 2A). Un indice di fusione è stato poi calcolato, e differenziando mioblasti sono stati visti per aumentare progressivamente il loro indice di fusione da 0,45% (giorno 1) a 31,4% (giorno 6) (Figura 2B). L’indice di fusione derivato in questo modo si confronta favorevolmente con l’indice calcolato utilizzando immunocitochimica standard (per rilevare MyHC) e colorazione nucleare (13). Per determinare se il software di analisi ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) potrebbe essere adattato per quantificare l’area delle miofibre (come misura di fusione), una macro è stato sviluppato e testato sulle immagini rappresentate dalla Figura 2A. La macro è impostata come segue e poi salvato:

• Aprire ImageJ e fare clic su “Plugins = > Macro = > Macro di avvio”

• Sostituire il testo esistente con la codifica mostrata nella tabella supplementare S1.

Le immagini vengono aperte in ImageJ, e la macro viene eseguita cliccando “Macros = > Run Macro”. Questo analizzerà le immagini una alla volta. L’utente deve confermare che la soglia è stata impostata correttamente; solo l’area delle miofibre dovrebbe essere analizzata. La soglia di colore può essere cambiata modificando la linea della macro “setThreshold(0,130)”; aumentando il secondo numero, saranno incluse più aree leggermente macchiate, mentre più aree sono escluse quando questo numero è ridotto. Utilizzando questo metodo, area miofibra raggiunto 29,6% al giorno 6 (Figura 2C), confrontando bene con l’indice di fusione calcolato per il punto stesso tempo (Figura 2B). Jenner e coloranti Giemsa può essere utilizzato anche per macchiare miotubi per la microscopia ottica in modo molto simile a LADD, tuttavia colorazione con LADD è molte volte più veloce, e la macro ImageJ abbiamo sviluppato permette un maggiore controllo su quali aree sono misurate (14).

Per convalidare ulteriormente l’uso della macchia multipla LADD per l’analisi di fusione, cellule C2C12 sono state differenziate per 5 giorni in presenza o in assenza di 10 µM BB94 (Cat. #ab142087; Abcam, Cambridge, UK) e successivamente fissato e colorato con LADD come descritto in precedenza. Il BB94 è un inibitore sintetico della metalloproteasi di matrice disponibile in commercio che ha precedentemente dimostrato di ridurre la fusione dei mioblasti (15,16). In presenza di BB94, l’indice di fusione è diminuito significativamente dal 50% (controllo DMSO) al 22% (P < 0,05) (Figura 2D); analisi della zona miofibra rivelato la stessa tendenza, con fusione ridotto dal 46% (controllo DMSO) al 21% (P < 0.05) in presenza di BB94 (Figura 2E).

Qui, presentiamo un metodo rapido, romanzo per la colorazione sia struttura miofibra e associati myonuclei utilizzando il LADD Multiple Stain. ImageJ viene successivamente utilizzato per valutare con precisione l’area delle fibre muscolari come misura di fusione. Il costo relativamente basso di LADD e il tempo notevolmente ridotto richiesto per l’elaborazione e l’analisi significa che la fusione può ora essere analizzata rapidamente in un laboratorio standard senza la necessità di immunocitochimica e microscopia a fluorescenza.