Axial Resolution

1.43.2 The Case for Superresolution Microscopy Techniques

Le risoluzioni laterali e assiali nel microscopio ottico sono fondamentalmente limitate dalla diffrazione nel rapporto tra la lunghezza d’onda della luce e l’apertura, o angolo di accettazione, dell’obiettivo usato per l’immagine, come descritto da Ernst Abbe nel 1873. Nella dimensione laterale, questo limite di risoluzione è di circa 200 nm, e nella dimensione assiale il limite è di circa 500 nm. Il limite di diffrazione della microscopia ottica deriva dai limiti fondamentali dell’ottica utilizzata nella formazione dell’immagine. Se consideriamo l’immagine formata da una sorgente di luce sferica in sub-risoluzione, troviamo che l’immagine che risulta anche da un’ottica di microscopio perfettamente corretta e senza aberrazioni non è descritta da una semplice sfera. Infatti, si osserva una complessa distribuzione di intensità 3D nel punto focale, e questa distribuzione di intensità 3D può essere descritta matematicamente dalla funzione di diffusione del punto (PSF) (Figura 1). Il massimo centrale della PSF contiene l’86,5% dell’intensità energetica totale disponibile. In entrambe le dimensioni laterale e assiale, l’intensità energetica rimanente è mappata in una serie di massimi e minimi in modo simmetrico alla rotazione. È l’interazione delle PSF delle caratteristiche adiacenti dell’immagine che determina in ultima analisi il limite di risoluzione di diffrazione del microscopio ottico.

Figura 1. Le mappe d’intensità XY (a) e XZ (b) di una funzione di diffusione del punto ideale.

Quando due oggetti si avvicinano nello spazio, le loro PSF si sovrappongono e presto i due oggetti non possono essere discriminati l’uno dall’altro. La sovrapposizione minima di due PSF che può essere tollerata prima che si perda la capacità di distinguerle l’una dall’altra è stata descritta come il punto in cui l’intensità scende di circa il 25% tra le due PSF. Il punto in cui si raggiunge questo calo di intensità è equivalente alla distanza tra il massimo centrale e il primo minimo della PSF. È molto difficile determinare con precisione questa distanza perché è difficile posizionare accuratamente il minimo, e invece si usa la metà della larghezza massima (FWHM) del massimo centrale della PSF.

Da entrambe le equazioni, vediamo che le risoluzioni laterali e assiali dipendono dall’apertura numerica del sistema ottico che raccoglie la luce e dalla lunghezza d’onda della luce stessa. Il miglioramento del potere risolutivo deriva dall’utilizzo di obiettivi ad alta apertura numerica e da lunghezze d’onda della luce più corte. Altri fattori come la luminosità relativa dei due oggetti (contrasto) influenzano questa distanza minima risolvibile. In termini pratici, nell’imaging al microscopio, sia una sufficiente apertura numerica ottica che un sufficiente contrasto sono necessari per visualizzare accuratamente i dettagli subcellulari.

Abbassare la lunghezza d’onda dell’illuminazione nella gamma ultravioletta per migliorare la risoluzione limita le scelte delle sonde fluorescenti, e spinge i limiti delle correzioni ottiche e le proprietà di trasmissione del percorso ottico del microscopio. Ulteriori complicazioni derivano dall’uso dell’illuminazione ultravioletta negli studi sulle cellule vive, dove molti ricercatori hanno notato gli effetti deleteri di queste lunghezze d’onda sulla vitalità delle cellule a lungo termine. I design ottici moderni hanno migliorato le aperture numeriche delle lenti, anche se il miglioramento reale in questo senso è venuto solo con l’uso di supporti di montaggio esotici e materiali coverglass. Entrambe queste strategie non riescono a fare più di un modesto miglioramento nella risoluzione e vengono a scapito di essere impraticabili per gli studi sulle cellule viventi.

Microscopia confocale biologica, che utilizza un’apertura a foro stenopeico per migliorare il contrasto in-focus attraverso la rimozione efficace della luce parassita dai piani oggetto fuori fuoco, è diventato uno strumento di imaging standard nello studio delle relazioni struttura-funzione cellulare. Il miglioramento della visualizzazione del piano dell’immagine a fuoco permette di raggiungere più facilmente i limiti pratici di diffrazione della risoluzione quando lo strumento è regolato criticamente. Teoricamente, con aperture di pinhole inferiori a 1 unità Airy, le risoluzioni laterali e assiali migliorano effettivamente fino a un limite di 1,4 volte quello del caso del microscopio a largo campo. Tuttavia, in pratica, i diametri dei pinhole inferiori a 1 unità Airy forniscono troppa poca luce per l’imaging biologico, poiché gran parte dell’emissione in-focus viene respinta dal pinhole insieme alla luce indesiderata fuori-focus. Per l’imaging biologico, dove di solito si lotta per ottenere il segnale di emissione, il rifiuto di una parte di questo segnale limitato per un piccolo guadagno in risoluzione non è pratico. Infatti, quando il segnale di emissione dal campione è limitato, di solito si sceglie di aprire il foro stenopeico a diametri maggiori di 1 unità Airy per raccogliere più segnale a scapito di uno spessore maggiore della fetta ottica. A questi diametri di pinhole, la risoluzione del microscopio confocale è essenzialmente la stessa di quella di un microscopio fluorescente convenzionale a largo campo.

Questo non vuol dire che non si possano rilevare oggetti più piccoli del limite di risoluzione – la rilevazione anche a livello di singole molecole è possibile, e ora relativamente semplice usando le moderne tecnologie di rilevazione. La rimozione completa dell’illuminazione diretta che entra nell’obiettivo nella microscopia in campo oscuro crea un contrasto eccellente in modo che anche la piccola quantità di luce diffusa da oggetti a diffrazione limitata come i microtubuli (25 nm di diametro) sia facilmente osservabile. La microscopia a fluorescenza fornisce anche eccellenti condizioni di contrasto che possono permettere l’osservazione e la registrazione di oggetti che hanno dimensioni ben al di sotto del limite di diffrazione della risoluzione. Con la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF), il contrasto è migliorato rispetto alla microscopia a fluorescenza standard ad ampio campo, limitando l’eccitazione assiale a poche centinaia di nanometri dell’interfaccia fluido-vetro, utilizzando l’energia luminosa evanescente e vicina al campo per l’eccitazione del fluoroforo. In queste condizioni, anche la mobilità di una singola molecola può essere tracciata nel tempo all’interno di una sezione ottica molto sottile. Tuttavia, né la microscopia in campo scuro né quella TIRF migliorano la risoluzione del sistema ottico – entrambe le tecniche si basano su grandi differenze di contrasto tra l’oggetto di interesse e lo sfondo per consentire il rilevamento in sub-risoluzione.

Superare i classici limiti di risoluzione della diffrazione ha rappresentato una grande sfida nella moderna microscopia ottica. I benefici derivanti dal miglioramento della nostra capacità di risolvere dettagli più fini dal microscopio ottico sono ovvi. Una maggiore risoluzione permetterebbe una descrizione strutturale più accurata delle organizzazioni molecolari fondamentali per la fisiologia e il comportamento cellulare normale e anormale. Le dissezioni molecolari e biochimiche vanno solo così lontano nel rivelare la complessità delle organizzazioni funzionali come quelle trovate nei contatti focali di adesione. Essere in grado di visualizzare direttamente, con risoluzioni che si avvicinano alla dimensione molecolare, queste organizzazioni funzionali aumenterebbe sostanzialmente la nostra comprensione delle interrelazioni molecolari e dei cambiamenti nell’organizzazione relativi agli stati funzionali o fisiologici. Recentemente, un certo numero di ricercatori ha sfruttato diverse strategie per fornire miglioramenti sostanziali (da 2 a 10 volte o meglio) nei classici limiti di risoluzione laterale e assiale. Queste tecniche rientrano in due categorie generali: quelle che si basano sui cambiamenti nell’illuminazione del campione, e quelle che utilizzano strategie di rilevamento di singole molecole insieme alla dimensione temporale per costruire un’immagine superrisolta.

Per gli scopi di questo articolo, sono state scelte le tecniche che hanno portato allo sviluppo e all’introduzione di strumenti commerciali da diversi produttori. L’utilizzo di questo criterio specifico nella selezione dei metodi discussi di seguito non è in alcun modo da interpretare come un’approvazione di queste tecniche rispetto ad altre che sono state introdotte nella letteratura. Con l’ulteriore sviluppo del lavoro in questo campo in rapida evoluzione, è possibile che nuovi metodi e approcci superino quelli descritti di seguito. Tuttavia, l’introduzione di questi strumenti commerciali sul mercato consente a una vasta gamma di biologi di diverse discipline di applicare metodi di super-risoluzione alle loro specifiche domande biologiche, portando questi metodi fuori dai laboratori di sviluppo specializzati. I lettori sono incoraggiati a studiare da soli le immagini di alta qualità contenute nel materiale supplementare online che accompagna molti degli articoli di riferimento.