Biotinilazione efficiente e purificazione in un solo passaggio di fattori di trascrizione etichettati in cellule di mammifero e topi transgenici

Risultati

Biotinilazione efficiente di Tagged GATA-1 in cellule trasfettate. Lo schema per la biotinilazione specifica in vivo di proteine etichettate in cellule di mammifero è delineato in Fig. 1A. Secondo questa procedura, un piccolo (23 aa) peptide tag è fuso alla proteina di interesse e coespresso in cellule insieme a BirA, una proteina batterica-biotina ligasi (20). Il tag peptidico utilizzato è stato precedentemente isolato da una libreria di peptidi sintetici schermati per BirA-mediata biotinilazione, che si verifica specificamente al residuo di lisina del tag (16). Ricerche nel database delle proteine non hanno identificato proteine presenti in natura che possiedono un motivo di sequenza simile a quella del tag peptide.

La proteina che abbiamo etichettato nel testare questo sistema era l’essenziale murino ematopoietico fattore di trascrizione GATA-1 (per la revisione, vedi rif. 25). Il tag è stato fuso N-terminalmente a GATA-1 ed espresso sotto il controllo di una cassetta di espressione di β-globina umana in cellule MEL, che possono essere indotte a subire la differenziazione terminale delle cellule eritroidi (22). BirA è stato anche clonato ed espresso in cellule MEL utilizzando la cassetta di espressione della globina umana. I cloni corrispondenti a singoli e doppi trasfettanti stabili per GATA-1 e BirA sono stati isolati e inizialmente controllati per l’espressione di entrambi i costrutti. Nel caso di GATA-1, l’analisi Western blot utilizzando un anticorpo GATA-1 rileva la più lenta migrazione della proteina etichettata così come il GATA-1 endogeno in estratti nucleari da cellule trasfettate (Fig. 1B, corsie 1 e 2). L’espressione di BirA è stata analizzata a livello di RNA (dati non mostrati).

Abbiamo poi testato, su trasfettanti stabili selezionati, se la proteina taggata GATA-1 era biotinilata da BirA. Testando estratti nucleari da cloni di cellule MEL utilizzando un coniugato streptavidina-HRP ha mostrato un segnale robusto corrispondente alla proteina GATA-1 etichettato, rilevabile solo nella corsia del taggato GATA-1/BirA doppio trasfettante (Fig. 1B, corsia 5). Nessuna biotinilazione di GATA-1 etichettato è visibile in assenza di BirA (Fig. 1B, corsia 6). Questi risultati confermano che la proteina BirA è sintetizzata in una forma attiva nelle cellule MEL trasfettate. Inoltre, molto poco biotinilazione sfondo aspecifico è osservato in estratti nucleari delle cellule MEL esprimendo solo BirA (Fig. 1B, corsia 7). Concludiamo quindi che l’espressione della proteina batterica BirA-biotina ligasi in cellule MEL può specificamente biotinilare un fattore di trascrizione dei mammiferi con un tag peptidico unico.

Abbiamo poi testato l’efficienza della biotinilazione legando GATA-1 taggato in estratti nucleari grezzi per streptavidina Dynabeads paramagnetico (Fig. 1C). Analisi del materiale eluito dalle perline ha mostrato che quasi tutta la proteina GATA-1 etichettato è stato legato (confrontare la corsia 2 alle corsie 1 e 3, Fig. 1C). Ripetizione dello stesso filtro con streptavidina-HRP mostra efficienza ≈100% nella biotinilazione e la cattura di GATA-1 etichettato dalle perle (Fig. 1C, corsie 4 e 5). Inoltre, coerentemente con quanto visto in Fig. 1B, c’è poco legame di fondo delle proteine biotinilate endogene alle perline, come rilevato da streptavidina-HRP (Fig. 1C, corsia 5). Questi dati dimostrano che taggato GATA-1 è molto efficiente biotinilato e recuperato da estratti di streptavidina legame, con biotinilazione sfondo trascurabile.

Purificazione a un solo passo di biotinilato GATA-1 da estratti nucleari grezzi da Streptavidin Binding. Abbiamo anche esplorato la fattibilità di un singolo passo di purificazione per isolare GATA-1 biotinilato da estratti nucleari grezzi legandosi direttamente a perline di streptavidina sotto stringenza moderata (150 mM NaCl/0,3% Nonidet P-40/200 ng/μl sieroalbumina di pollo). Abbiamo provato prima un legame di controllo da 5 mg di estratti nucleari grezzi da cellule MEL che esprimono solo BirA (Fig. 2, corsia 4). Il materiale eluito consisteva di circa cinque bande fortemente macchiato contro uno sfondo di bande molto più deboli (Fig. 2, corsia 5). Abbiamo identificato le proteine vincolanti sfondo escindendo l’intera corsia dal gel e analizzandolo da cromatografia liquida-tandem MS. Le proteine così identificate sono classificate nella tabella 1 secondo la funzione biologica e il comparto cellulare, come definito dal Gene Ontology Consortium (www.geneontology.org). I risultati hanno mostrato che le proteine di fondo più abbondanti identificati erano le carbossilasi naturalmente biotinilati ed enzimi associati, che in gran parte coincidevano con le bande intensamente colorazione. Abbiamo anche trovato il legame di fondo di abbondanti proteine nucleari coinvolte nell’elaborazione dell’mRNA, come i fattori di splicing, così come delle proteine ribosomiali. Insieme, queste tre classi di proteine rappresentavano >80% del legame di fondo nelle condizioni utilizzate (tabella 1). È notevole che molto pochi peptidi sono stati identificati come corrispondenti a fattori coinvolti nella regolazione trascrizionale (Tabella 1). Concludiamo che il legame di fondo per perline streptavidina è dovuto principalmente alle proteine biotinilate endogene così come abbondanti fattori nucleari coinvolti nella lavorazione del mRNA e la sintesi del ribosoma e l’assemblaggio, con molto poco legame aspecifico di fattori coinvolti nella regolazione / attivazione trascrizionale.

Abbiamo poi provato a legare una quantità simile di estratto nucleare grezzo (5 mg) da taggato GATA-1/BirA doppio transfettanti, nelle stesse condizioni (Fig. 2, corsia 2). Il modello di colorazione della corsia con il materiale eluito (Fig. 2, corsia 3) è stato significativamente diverso da quello osservato con il legame di fondo in corsia 5, indicando un arricchimento significativo in proteine coeluting con tag GATA-1 (Fig. 2, corsia 3 vs corsia 5). Biotinilato GATA-1 e proteine coeluting può diluire fuori o competere per il legame con le proteine aspecifiche osservate nella corsia 5. L’arricchimento proteico visibile nella corsia 3 può quindi corrispondere a proteine copurificate che interagiscono con GATA-1. Nel materiale eluito, abbiamo anche osservato una banda fortemente macchiato che migra con una dimensione simile a quella prevista per taggato GATA-1 (Fig. 2, freccia, corsia 3). Abbiamo confermato la presenza di GATA-1 in questa banda per escissione del gel e MS. L’analisi dettagliata di tutte le proteine copurificazione con tag GATA-1 sarà pubblicato altrove (P.R., F.G., e J.S., risultati non pubblicati). Presi insieme, questi dati dimostrano la biotinilazione quantitativa di taggato GATA-1 in cellule MEL e la sua purificazione efficiente da estratti proteici grezzi in un unico passaggio procedura di legame diretto a perline streptavidina, con poche bande di legame sfondo corrispondente principalmente alle proteine biotinilati endogenamente e facilmente identificabili abbondanti proteine nucleari / nucleari.

Biotinilazione non influenza la proteina-interazione o DNA-Binding proprietà di GATA-1. Poiché è possibile che l’aggiunta del tag peptidico e/o la biotinilazione possano influenzare le proprietà della proteina etichettata, abbiamo testato se GATA-1 biotinilato potrebbe ancora subire interazioni proteina-proteina con un noto partner di GATA-1, come FOG-1 (26), e se potrebbe legarsi in vivo a noti obiettivi del gene GATA-1 come il promotore della globina βmaj del mouse. Abbiamo effettuato un esperimento di pull-down di GATA-1 biotinilato legando estratti nucleari a perline di streptavidina e testato se FOG-1 era anche copurificato. Abbiamo trovato FOG-1 per essere tirato giù da estratti che esprimono biotinilato GATA-1 ma non da estratti che esprimono BirA solo (Fig. 3A, corsie 2 e 4). Abbiamo anche trovato FOG-1 per essere copurificare con biotinilato GATA-1 da MS. Abbiamo anche effettuato una cromatina pull-down (ChIP) esperimento in cui cromatina sonicata da formaldeide-crosslinked cellule MEL è stato incubato con perline streptavidina, seguita da eluizione del materiale legato e il recupero del DNA tirato giù. Utilizzando primer specifici per il promotore βmaj, abbiamo trovato un arricchimento per queste sequenze nel DNA tirato giù dalla cromatina delle cellule che esprimono GATA-1 biotinilato ma non dalle cellule che esprimono BirA (Fig. 3B). Abbiamo anche scoperto che la biotinilazione non influenza la distribuzione subnucleare normalmente osservata con GATA-1 (Fig. 5, che è pubblicato come informazioni di supporto sul sito web PNAS; rif. 27) e che GATA-1 biotinilato mostra un profilo di frazionamento biochimico identico a GATA-1 endogeno negli estratti nucleari delle cellule MEL (dati non mostrati). Presi insieme, questi risultati forniscono una forte evidenza che le proprietà di GATA-1 non sono influenzate dalla biotinilazione tagging. Inoltre, questi dati dimostrano anche l’applicazione di tagging biotinilazione come alternativa agli anticorpi in metodi che coinvolgono una fase di purificazione di affinità, come la proteina pull-downs o un saggio ChIP.

Biotinilazione Tagging in topi transgenici. La capacità di isolare direttamente la proteina biotin-tagged da estratti grezzi in un unico passaggio solleva la prospettiva di utilizzare questo approccio nella purificazione delle proteine taggate da fonti limitanti come i tessuti del topo. Abbiamo quindi testato se BirA-mediata biotinilazione tagging funzionerebbe anche in vivo in topi transgenici. Poiché la sovraespressione di GATA-1 porta alla letalità embrionale nei topi (28), abbiamo testato questo approccio etichettando il fattore di trascrizione eritropoietico essenziale EKLF (29). Il cDNA di EKLF del topo è stato marcato con il tag di biotinilazione e un doppio epitopo di emoagglutinina e microiniettato in uova di topo per stabilire linee di topo transgeniche. Allo stesso modo, linee di topi transgenici sono stati stabiliti anche da microiniettare il BirA / eritroide cassetta di espressione costrutto. Linee di topi transgenici con espressione rilevabile di EKLF taggato e BirA in cellule eritroidi sono stati selezionati e incrociati. In vivo biotinilazione di EKLF etichettato è stato valutato in estratti nucleari preparati dal fegato fetale di 13.5 giorni embrioni postcoitum. Analisi Western blot con un anticorpo anti-EKLF rilevato EKLF endogeno così come taggato EKLF, che è stato visualizzato come un doppietto (Fig. 4, corsia 1). Legame degli estratti nucleari di fegato fetale a perline streptavidina mostra che solo la banda superiore del doppietto viene mantenuto, suggerendo che è biotinilato (Fig. 4, corsie 2 e 3). Questa osservazione è confermata sondando lo stesso blot con streptavidina-HRP, che rileva solo una singola banda (Fig. 4, corsie 7 e 9). Il doppietto rilevato dall’anticorpo EKLF è molto probabilmente dovuto all’utilizzo differenziale dei codoni di iniziazione della traduzione al tag di biotinilazione fuso N-terminalmente (banda superiore) e al doppio epitopo dell’emoagglutinina presente immediatamente a valle, che contiene anche un codone di iniziazione (banda inferiore). Come risultato, solo la banda superiore che porta il tag di biotinilazione serve come substrato per BirA, dimostrando così ulteriormente la specificità in vivo di questo approccio. Il legame di estratti nucleari a perline streptavidina anche mostrato che una percentuale significativa (≈50%) di tag EKLF è biotinilato nel fegato fetale di topi transgenici. Noi ipotizziamo che la differenza di efficienza biotinilazione tra le cellule trasfettate e fegati fetali (a parte l’uso di diverse proteine di fusione) può riflettere una limitazione in vivo nella disponibilità di biotina (biotina è abbondante nel FCS utilizzato per integrare i mezzi di coltura cellulare) o una differenza nei livelli di espressione BirA. Questi risultati dimostrano che la biotinilazione specifica di EKLF marcato da BirA batterico può anche essere raggiunto con alta efficienza in vivo in topi transgenici.