BRAF nel melanoma: ESMO Biomarker Factsheet

Definizione di BRAF

BRAF (v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1) è una proteina chinasi serina/treonina che gioca un ruolo critico nella via di segnalazione cellulare RAS-RAF-MEK-ERK mitogen activated protein kinase (MAPK). L’attivazione di questa via trasferisce i segnali extracellulari attraverso la cellula attraverso una cascata di eventi di fosforilazione, portando a un’espressione genica alterata, alla crescita cellulare, alla sopravvivenza e alla differenziazione in cellule normali e trasformate.

BRAF è un potente oncogene che viene attivato in circa l’8% di tutti i tumori. Mutazioni puntiformi di BRAF sono state identificate in una vasta gamma di tumori solidi e in un sottoinsieme di tumori maligni ematologici, e sono particolarmente prevalenti nei melanomi. La maggior parte delle mutazioni BRAF si verificano all’interno del dominio di attivazione della chinasi, che si traduce nell’attivazione costitutiva di BRAF e nella fosforilazione di MEK, indipendente dall’attivazione a monte da parte delle tirosin-chinasi del recettore o di RAS. Questo genera un’attivazione costitutiva non contrastata di ERK, che porta alla promozione della crescita cellulare e all’evasione dell’apoptosi e, infine, alla trasformazione neoplastica. La mutazione BRAF più comune, trovata in più del 90% dei tumori BRAF-mutati, è una sostituzione di una valina con un acido glutammico all’aminoacido 600 (V600E) nel dominio di attivazione della chinasi. Questa sostituzione imita la fosforilazione del loop di attivazione, inducendo così l’attività costitutiva della proteina chinasi BRAF.

Mutazioni BRAF nel melanoma

Mutazioni BRAF attivanti sono presenti in circa il 50% di tutti i melanomi. Circa il 90% di queste mutazioni si verifica all’aminoacido 600, la maggior parte delle quali sono mutazioni BRAF V600E. Altre mutazioni sono state registrate al codone 600, tra cui BRAF V600K, V600D e V600M.

L’alta frequenza di mutazioni BRAF nel melanoma implica che questo oncogene può essere un interessante bersaglio terapeutico e ha portato a una nuova era di terapia mirata per il melanoma avanzato.

BRAF come biomarcatore prognostico nel melanoma

Prima dell’approvazione degli inibitori di BRAF, i pazienti con melanoma BRAF-mutato avevano una prognosi peggiore di quella dei pazienti la cui malattia esprimeva BRAF wild-type. Un certo numero di studi ha dimostrato in pazienti con melanoma metastatico, un’associazione tra la presenza di una mutazione BRAF e prognosi peggiore dalla diagnosi di prima metastasi o resezione di metastasi. Tuttavia, la presenza di una mutazione BRAF non sembra avere alcun impatto sull’intervallo libero da malattia dalla diagnosi del primo melanoma alla prima metastasi a distanza. I pazienti con melanoma BRAF positivo tendono ad essere più giovani e ad avere una sopravvivenza più povera rispetto ai pazienti con melanoma wild-type alla diagnosi. Mentre nessuna caratteristica clinica specifica della malattia metastatica è stata ancora correlata allo stato di mutazione BRAF, il melanoma primario dei mutanti BRAF è stato associato a specifiche caratteristiche clinicopatologiche tra cui il sito (tronco), l’età più precoce di insorgenza, e la mancanza di danno solare cronico nella pelle circostante.

BRAF come biomarcatore predittivo nel melanoma

Le terapie mirate a BRAF mostrano una notevole efficacia nel melanoma BRAF-mutato e la presenza di una mutazione BRAF V600 serve come biomarcatore predittivo di risposta. Due inibitori BRAF, vemurafenib e dabrafenib, e un inibitore MEK, trametinib, sono stati approvati in Europa per il trattamento di pazienti adulti con melanoma non resecabile o metastatico con una mutazione BRAF V600. Il trattamento dei pazienti con melanoma BRAF-mutato con queste terapie mirate ha invertito la cattiva prognosi associata a questa alterazione molecolare. Questi pazienti hanno ora una sopravvivenza mediana più lunga rispetto ai pazienti con melanoma BRAF wild-type.

Gli inibitori BRAF vemurafenib e dabrafenib si legano specificamente a e sopprimono l’attività BRAF e la segnalazione a valle nelle cellule contenenti una mutazione BRAF V600. Negli studi clinici, entrambi questi composti hanno dimostrato risposte cliniche profonde nei pazienti con melanoma con mutazioni BRAF V600, con un aumento significativo della sopravvivenza libera da progressione e complessiva rispetto alla chemioterapia standard-of-care.

L’inibitore MEK, trametinib, si lega a MEK non fosforilato, impedendo la fosforilazione e l’attivazione MEK dipendente da RAF. Negli studi clinici, anche se il tasso di risposta globale ottenuto non era così alto come quello per vemurafenib o dabrafenib, trametinib ha dimostrato una migliore sopravvivenza libera da progressione e complessiva rispetto alla chemioterapia standard-of-care. L’evidenza suggerisce che trametinib non ha attività clinica nei pazienti che sono progrediti con una precedente terapia con inibitori BRAF, ma i dati di studi clinici recenti mostrano che il trattamento combinato con dabrafenib e trametinib migliora l’efficacia senza peggiorare gli effetti collaterali, rispetto a uno dei due agenti da solo. Questa combinazione è stata approvata dalla FDA per il trattamento di pazienti con melanoma con mutazioni BRAF V600.

Il successo di queste terapie mirate nei pazienti con melanoma BRAF-mutato porta alla raccomandazione che i pazienti con melanoma metastatico o non resecabile dovrebbero essere sottoposti a screening per le mutazioni BRAF V600 in una lesione metastatica (preferibilmente) o nel tumore primario per aiutare a guidare la decisione terapeutica.

Resistenza all’inibizione di BRAF

Un piccolo sottogruppo di pazienti con melanoma BRAF-mutato non risponde al trattamento con inibitori BRAF o MEK a causa di meccanismi intrinseci di resistenza, e la maggior parte dei pazienti che inizialmente rispondono a queste terapie alla fine sviluppano un meccanismo di resistenza acquisita, portando alla malattia progressiva. Ci sono molteplici possibili meccanismi di resistenza e la maggior parte dei meccanismi descritti finora coinvolgono la riattivazione della via MAPK. Le mutazioni NRAS e le varianti di splice dell’mRNA di BRAF V600E sono meccanismi comuni identificati fino ad oggi. L’attivazione della via PI3K-PTEN-AKT ha anche dimostrato di avere un ruolo nella resistenza acquisita agli inibitori di BRAF.

Ci sono diversi inibitori di RAF attualmente in sviluppo preclinico e clinico, ognuno con diverse proprietà volte a superare i meccanismi di resistenza che possono limitare l’efficacia di questi farmaci.

Raccomandazioni sui test BRAF nel melanoma

Vemurafenib, dabrafenib e trametinib sono indicati per i pazienti con melanoma non resecabile o metastatico, che hanno un tumore positivo alla mutazione BRAF V600 confermato da un test convalidato eseguito in un istituto accreditato (certificato) che include adeguati controlli di qualità.

Sono disponibili diversi metodi per rilevare le mutazioni BRAF V600, tra cui la reazione a catena della polimerasi in tempo reale specifica per la mutazione (RT-PCR), il sequenziamento Sanger, il pirosequenziamento, l’analisi di conformazione e l’analisi di fusione ad alta risoluzione.

Due test diagnostici di accompagnamento RT-PCR sono stati sviluppati insieme a vemurafenib e dabrafenib per valutare l’idoneità dei pazienti all’arruolamento negli studi clinici; il test di mutazione cobas® 4800 BRAF V600 e il test THxID®-BRAF di bioMerieux (bMx), rispettivamente. Entrambi i test hanno l’approvazione FDA e CE-IVD per la rilevazione di mutazioni BRAF e prevedono l’estrazione di DNA genomico da un campione di tumore fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE) e un test RT-PCR che rileva sia il BRAF wild-type che quello mutante. Il test cobas® 4800 è progettato per rilevare la mutazione BRAF V600E predominante con alta sensibilità (fino al 5% di sequenza V600E in uno sfondo di sequenza wild-type da DNA derivato da FFPE) e rileva anche le mutazioni BRAF V600D e V600K meno comuni con sensibilità inferiore. Il test THxID®-BRAF è stato progettato per rilevare le mutazioni BRAF V600E e V600K con alta sensibilità (fino al 5% di sequenza V600E e V600K in uno sfondo di sequenza wild-type utilizzando il DNA estratto dal tessuto FFPE) e rileva anche la mutazione BRAF V600D meno comune e la mutazione V600E/K601E con sensibilità inferiore . Tuttavia, in Europa sono disponibili diversi metodi CE-IVD per i test BRAF.

Assicurare la qualità e la tempestività dei risultati dei test sulle mutazioni BRAF

E’ importante che tutti i pazienti con melanoma eleggibili per le terapie con inibitori BRAF siano valutati per la mutazione BRAF in modo accurato, affidabile e tempestivo in modo che i risultati possano essere adeguatamente applicati alla gestione clinica del paziente.

La disponibilità dei risultati della mutazione BRAF per i medici può essere influenzata da:

• il punto durante il percorso del paziente in cui viene richiesto il test,
• la fase e l’urgenza clinica dei pazienti selezionati per il test della mutazione BRAF,
• il tempo di esecuzione del test della mutazione BRAF stesso,
• e come i risultati vengono trasmessi ai medici curanti.

Quale tecnica e quale algoritmo dovrebbero essere usati per l’analisi dello stato di BRAF nel melanoma?

Tutti i metodi usati per rilevare le mutazioni BRAF hanno vantaggi e svantaggi, e la scelta di usare uno piuttosto che l’altro si basa solitamente sulle pratiche locali correnti e sull’esperienza nei diversi laboratori clinici.

I parametri che dovrebbero essere considerati quando si sceglie un test diagnostico di accompagnamento adatto includono la sensibilità, la specificità, il limite della sensibilità analitica e i tassi di fallimento .

I metodi per aumentare la sensibilità e la specificità e per ridurre i tassi di fallimento includono:

• validare accuratamente il metodo scelto attraverso il confronto con i metodi “gold-standard”,
• eseguire la macrodissezione dei campioni per aumentare la sensibilità della tecnica,
• scegliere piccoli ampliconi per l’amplificazione PCR per ridurre il tasso di fallimento dovuto alla degradazione del DNA,
• convalida continua del metodo attraverso l’applicazione delle migliori pratiche e la partecipazione a controlli di qualità esterni .

Selezione dei pazienti

In linea con la licenza europea per vemurafenib, dabrafenib e trametinib, il test di mutazione BRAF è raccomandato nei pazienti con diagnosi di melanoma non resecabile o metastatico. Le linee guida europee affermano che il test di mutazione BRAF dei tumori primari in pazienti senza metastasi non è raccomandato.

Riferimenti chiave

1. Holderfield M, Deuker MM, McCormick F, et al. Targeting RAF kinases for cancer therapy: Melanoma BRAF-mutato e oltre. Nature Reviews Cancer 2014;14:455-67.
2. Davies H, Bignell GR, Cox C, et al. Mutazioni del gene BRAF nel cancro umano. Nature 2002;417: 949-54.
3. Gonzalez D, Fearfield L, Nathan P, et al. Algoritmo di test della mutazione BRAF per il trattamento con vemurafenib nel melanoma: raccomandazioni da un gruppo di esperti. Br J Dermatol 2013;168:700-7.
4. Long GV, Menzies AM, Nagrial AM, et al. Associazioni prognostiche e clinicopatologiche di BRAF oncogeno nel melanoma metastatico. J Clin Oncol 2011;29:1239-46.
5. Vemurafenib. Riassunto delle caratteristiche del prodotto. 2014.
6. Dabrafenib. Riassunto delle caratteristiche del prodotto. 2015.
7. Trametinib. Riassunto delle caratteristiche del prodotto. 2015.
8. Chapman PB, Hauschild A, Robert C, et al. Migliore sopravvivenza con vemurafenib nel melanoma con mutazione BRAF V600E. N Engl J Med 2011;364:2507-16.
9. Hauschild A, Grob JJ, Demidov LV, et al. Dabrafenib nel melanoma metastatico BRAF-mutato: un multicentrico, open-label, fase 3 studio randomizzato controllato. Lancet 2012;380:358-65.
10. Flaherty KT, Robert C, Hersey P, et al. Migliore sopravvivenza con inibizione MEK nel melanoma BRAF-mutato.N Engl J Med2012;367:107-14.
11. Flaherty KT, Infante JR, Daud A, et al. Inibizione combinata BRAF e MEK nel melanoma con mutazioni BRAF V600. N Engl J Med 2012;367:1694-703.
12. Dummer R, Hauschild A, Guggenheim M, et al. ESMO Guidelines Working Group. Melanoma cutaneo: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol 2012;23(Suppl 7):vii86-91.
13. Chapman PB. Meccanismi di resistenza all’inibizione di RAF nei melanomi che ospitano una mutazione BRAF Am Soc Clin Oncol Educ Book 2013; doi: 10.1200/EdBook_AM.2013.33.e80.
14. Shi H, Hugo W, Kong X, et al. Resistenza acquisita ed evoluzione clonale nel melanoma durante la terapia con inibitori BRAF. Cancer Discov 2014;4(1):80-93. doi: 10.1158/2159-8290.CD-13-0642. Epub 2013 Nov 21.