In molte applicazioni, si desidera la separazione di cellule bersaglio da miscele contenenti altre cellule con densità simili, ma dimensioni diverse (leggermente o sostanzialmente). Gli esempi includono la generazione di colture cellulari sincronizzate in cui si isolano le cellule in una particolare fase del loro ciclo (caratterizzata dalla loro dimensione) (1-2), l’isolamento dei corticotropi da altre cellule ipofisarie (3) e l’ordinamento di varie sottopopolazioni di monociti (4). Il metodo di scelta per separare le popolazioni di cellule basate su differenze di velocità di sedimentazione (soprattutto quando le differenze di densità non sono significative) è un processo chiamato elutriazione centrifuga (5). Qui, i separandi (di solito cellule) sono sottoposti a due forze: (i) una forza centrifuga che li fa sedimentare con una velocità che è una funzione della loro densità e dimensione, e (ii) un flusso convettivo in direzione opposta che imprime una velocità fissa a tutte le cellule. Il flusso e/o la velocità di centrifugazione possono essere regolati per raccogliere solo le cellule la cui velocità di sedimentazione rientra in un determinato intervallo. Mentre questo processo è stato anche utilizzato con successo per separare le cellule batteriche da matrici in cui sono presenti (6) (la nostra applicazione di interesse), la necessità di attrezzature specializzate serve come un impedimento per molti laboratori.
Mentre ci sono una serie di protocolli che sono stati descritti per isolare i batteri da varie matrici come il cibo (7-8), suolo (9), e tappeti microbici (10) che fanno uso di centrifughe da banco facilmente disponibili per separare le cellule sulla base di diverse velocità di sedimentazione, i protocolli raccomandati spesso sembrano essere ad hoc. Per esempio, Wang et al. (8) raccomandano la centrifugazione a <1000×g per un tempo non specificato per rimuovere i detriti quando si isolano i batteri dal formaggio molle, seguita dalla centrifugazione a 9000×g per 3 minuti per raccogliere i batteri. Allo stesso modo, per isolare i batteri dalla carne omogeneizzata, Neiderhauser et al. (7) raccomandano la centrifugazione a 100×g (per un tempo non specificato) per rimuovere le particelle di cibo, seguita dalla centrifugazione a 3000×g (di nuovo, per un tempo non specificato) per raccogliere i batteri. In altri casi, i protocolli raccomandati prevedono più cicli di centrifugazione. Per esempio, per isolare i batteri dai tappeti microbici, Bey et al. (10) raccomandano non solo la centrifugazione a 500×g per 15 minuti, ma anche la risospensione del sedimento e una ripetizione della procedura per quattro volte. Allo stesso modo, per isolare i batteri dal suolo, Bakken (9) raccomanda la centrifugazione ripetuta (per un “numero di volte”) dell’omogeneizzato del campione a 630-1060×g (per un tempo non specificato), seguita da risospensione e riomogenizzazione. Approcci simili sono stati proposti anche per isolare i batteri dal brodo di emocoltura “positivo”. Per ottenere isolati puri di batteri prima di determinare la loro identità utilizzando la spettrometria di massa MALDI-TOF, Stevenson et al. (11) hanno utilizzato una procedura di centrifugazione multi-fase che coinvolge fasi di centrifugazione sequenziale per “1-2 minuti” ciascuno a 8500, 1000 e 13.000 RPM (valore in g non specificato) con risospensione del pellet in diversi buffer ad ogni passo.
Questi protocolli citati non sono affatto gli unici esempi di protocolli di centrifugazione ad hoc caratterizzati da una scelta apparentemente arbitraria di velocità e/o tempi di centrifugazione. Una conseguenza importante di tali protocolli ad hoc è che non forniscono alcuna base razionale con la quale altri possono ideare protocolli per isolare diverse cellule bersaglio da altre matrici/miscele di cellule. Per esempio, è intuitivamente ovvio che una centrifugazione prolungata porterà alla sedimentazione di tutte le particelle, mentre una centrifugazione di breve durata sedmenterà solo le particelle più veloci, lasciando la maggior parte delle particelle più lente nella sospensione. Determinare la velocità/durata ottimale per la centrifugazione per isolare la particella di destinazione eliminando le altre, tuttavia, rimane più di un’arte. In altre parole, i protocolli attualmente riportati non forniscono una base razionale per la modifica (determinazione delle velocità/tempi di centrifugazione ottimali) per altri obiettivi di separazione/isolamento correlati.
Materiali e metodi
Teoria
Il nostro metodo proposto per separare due tipi di particelle che hanno densità simili, ma diverse velocità di sedimentazione a causa delle differenze di dimensioni, è illustrato nella Figura 1. All’inizio del processo (Figura 1(1)), la sospensione (brodo di emocoltura, nel nostro caso) contenente i separandi (globuli bianchi o WBC, globuli rossi o RBC, piastrine e batteri) viene caricata come strato separato sopra un tampone denso chiaro (Histopaque 1083, nel nostro caso). La densità del buffer è maggiore di quella dei WBC (ρ = 1.06 – 1.08 g/mL (12)) e delle piastrine (ρ = 1.05 – 1.07 g/mL (13)), ma inferiore a quella dei RBC (ρ = 1.1 g/mL (14)) e dei batteri (ρ = 1.105 g/mL per Escherichia coli (15)). Mentre la centrifugazione procede, tutte le particelle sono spinte verso il basso, prima attraverso lo strato superiore (mezzi di coltura del sangue), e poi nel tampone denso (l’Histopaque). Mentre le particelle con densità superiore a quella del tampone (RBC e batteri) sedimentano sia attraverso il brodo di emocoltura che il tampone denso, i separandi meno densi (WBC e piastrine) sono esclusi da quest’ultimo. Questo processo è simile al protocollo raccomandato per la separazione di WBC e piastrine dal sangue intero (16). Per il nostro scopo, tuttavia, questo processo da solo è insufficiente perché mentre alcune particelle indesiderate (WBC e piastrine) vengono rimosse dalle particelle di destinazione (batteri) sulla base delle differenze di densità, altre particelle con densità simili (RBC) rimangono. Per raggiungere il nostro obiettivo di raccogliere tutte le cellule bersaglio (batteri) eliminando tutte le particelle indesiderate rimanenti (RBC), proponiamo di portare il sistema allo stato raffigurato nella Figura 1(4), e fermare il processo di centrifugazione lì. In questo stato, tutti i globuli rossi, che, a causa delle loro dimensioni maggiori, hanno una maggiore velocità di sedimentazione, sono depositati sul fondo del tubo come un pellet, mentre tutte le cellule batteriche sono disperse nel buffer denso.
(1) Seperands caricati. (2) RBC (
) e batteri (
), che hanno una densità superiore a quella dell’Histopaque-1083, sedimentano attraverso di esso, mentre le piastrine (
) e i WBC (
), le cui densità sono inferiori, sono esclusi. Anche se i globuli rossi si depositano più velocemente dei batteri, i globuli rossi che partono dal piano A non hanno “superato” i batteri che partono dal piano B nel momento in cui sono raffigurati. Se la colonna Histopaque dovesse terminare nel punto indicato dalla linea tratteggiata, i globuli rossi e i batteri non potrebbero essere separati l’uno dall’altro. (3) Dopo un’ulteriore sedimentazione, i batteri e le RBC per “bande” separate. (4) Le RBC che si muovono più velocemente sono completamente depositate sul fondo della provetta, mentre tutti i batteri sono nello strato istopaco. Questo corrisponde alla durata ottimale per cui il processo dovrebbe essere eseguito. (5) Lasciando procedere la sedimentazione, sia i batteri che i globuli rossi raggiungono il fondo della provetta.
Per raggiungere questo stato desiderato, tuttavia, è necessario soddisfare una serie di vincoli. In primo luogo, al fine di garantire che tutti i batteri siano raccolti nel buffer, dobbiamo lasciare il tempo sufficiente per i batteri che hanno iniziato in cima (Piano A) per migrare attraverso lo strato di brodo di emocoltura (Medium 1) e nell’Histopaque (Medium 2). Matematicamente, questo significa che:
dove, t è il tempo per cui viene eseguito il processo di centrifugazione, l1 è la lunghezza della colonna di brodo per emocoltura caricata, e vb1 è la velocità di sedimentazione dei batteri in questo strato. Questo punto nel tempo (quando i batteri che partono dal piano A hanno appena attraversato il piano B ed entrano nel tampone) è rappresentato nella figura 1(2).
dove l1 e l2 sono le lunghezze delle colonne di brodo di emocoltura (mezzo 1) e di tampone (mezzo 2), rispettivamente; vR1 e vR2 sono le velocità di sedimentazione dei globuli rossi nel brodo e nel tampone, rispettivamente; e vb2 è la velocità di sedimentazione dei batteri nel tampone. L’equazione di cui sopra può essere riorganizzata per ottenere:
Inoltre, sarebbe auspicabile che tutti i batteri originariamente presenti nel mezzo 1 siano raccolti nel mezzo 2. Ciò significa che nel momento in cui i batteri che partono dall’alto (piano A) attraversano l’interfaccia tra le due fasi (piano B), quelli che partono dal piano B non devono aver raggiunto il fondo. Matematicamente, questa condizione è espressa come:
dove, vb1 è la velocità di sedimentazione dei batteri nel mezzo 1. Quanto sopra può essere riorganizzato per ottenere:
Se le equazioni (3) e (5) sono soddisfatte, allora il sistema raggiungerà lo stato raffigurato nella Figura 1(4) dove tutti i globuli rossi hanno raggiunto il fondo della provetta e formano uno strato separato, ma nessuno dei batteri lo ha fatto. (Sono tutti nel mezzo 2). Questo stato si verifica per la prima volta quando tutte le RBC (anche quelle che partono dal piano A) hanno raggiunto il fondo della provetta. Matematicamente, questo istante di tempo (t1) può essere rappresentato come:
Lo stato cessa di esistere quando i batteri (quelli inizialmente presenti all’interfaccia, cioè al piano B) iniziano a raggiungere il fondo del tubo. Il tempo in cui questo avviene (t2) è dato da:
Quindi, per ottenere la migliore separazione possibile, bisogna (i) assicurarsi che le lunghezze delle colonne dei due mezzi soddisfino le equazioni (3) e (5); e (ii) che la durata di esecuzione del processo di sedimentazione (tcentrifugazione) sia data da:
Continuare la centrifugazione più a lungo di t2 porterà alla situazione rappresentata dalla Figura 1(5), dove alcuni, o tutti, i batteri sedimentano anche sul fondo. Per ottenere isolati puri delle specie desiderate, il processo di centrifugazione deve essere fermato allo stadio corrispondente alla figura 1(4), lo strato superiore scartato e il tampone denso estratto senza disturbare il sedimento sul fondo. Se lo si desidera, le particelle bersaglio possono essere centrifugate e risospese in altri media.
Questa “finestra operativa” tra t1 e t2 è rappresentata schematicamente nella Figura 2. Qui, l’ascissa mostra il tempo di centrifugazione, mentre l’ordinata mostra la frazione di particelle di RBC e batteri che sono presenti nel tampone denso (mezzo 2). Per entrambi, la frazione inizialmente aumenta mentre migrano dallo strato superiore, rimane costante per un certo periodo di tempo mentre migrano come una banda attraverso il buffer denso, e infine diminuisce mentre si depositano sul fondo. Le RBC che si muovono più velocemente hanno una pendenza di salita/discesa più ripida, così come un periodo più breve quando tutte sono presenti nel buffer denso. Durante la “finestra di funzionamento” (riquadro nuvoloso), praticamente tutti i batteri (∼100%) sono presenti nel buffer, ma praticamente nessun RBC (∼ 0%) è presente.
Le velocità di sedimentazione degli RBC e dei batteri (che determinano i valori numerici dei vincoli dati dalle equazioni 3,5 e 8) possono essere previste in base alle loro rispettive forme, dimensioni e densità. La velocità di sedimentazione di è data (17) dall’equazione:
dove, ρ e ρl sono le densità della particella e del liquido, rispettivamente, µ è la viscosità del liquido, R è il raggio effettivo della particella, e g è l’accelerazione per gravità/centrifugazione. L’E. coli è un batterio a forma di bastoncino, lungo 2 micron e con un diametro di 0,5 micron (18). Quindi, possiamo modellarli come sferoidi prolati, il cui raggio di sedimentazione effettivo (R) è dato (19) da:
dove a e b sono le mezze lunghezze degli assi maggiore e minore. Così per E. coli, a = 1 micron e b = 0,25 micron. Sulla base di questi valori, ci aspettiamo che l’E. coli abbia una velocità di sedimentazione di 26,7 micron/secondo attraverso il liquido superiore, e una velocità di 6,56 micron/secondo attraverso l’istopaco 1083.
D’altra parte, le RBC umane sono dischi biconcavi, 7-8 micron di diametro e 2 micron di spessore (20). Possono quindi essere modellati come sferoidi oblati il cui raggio di sedimentazione effettivo è dato (19) da:
dove a e b sono rispettivamente la metà delle lunghezze degli assi maggiore e minore. Con valori di 4 micron per a, e 1 micron per b, prevediamo che quando vengono sottoposti a centrifugazione usando il nostro strumento, un Eppendorf-5804, con una forza centrifuga relativa di 400×g, gli RBC sedimenteranno con una velocità di 500 micron/secondo attraverso lo strato superiore di densità ∼1.02 g/mL (come misurato da noi), e 101 microns/secondo attraverso l’Histopaque (densità = 1.083 g/mL).
La velocità di sedimentazione delle particelle può essere prevista più accuratamente considerando le interazioni particella-particella. Queste interazioni particella-particella si verificano quando il liquido spostato verso l’alto da una particella in sedimentazione impatta con altre particelle immediatamente dietro o accanto alla prima, sottoponendo quest’ultima ad una maggiore resistenza del fluido e riducendo così la velocità effettiva (media) di sedimentazione delle particelle come gruppo. Questo fenomeno è chiamato “sedimentazione ostacolata” e deve essere preso in considerazione quando la frazione di volume delle particelle non è trascurabile. Un certo numero di espressioni semi-analitiche o empiriche sono disponibili per calcolare le velocità di sedimentazione effettiva per i sistemi con sedimentazione ostacolata (21). Uno di questi approcci è la Correlazione Richardson-Zaki, dove la velocità di sedimentazione effettiva (v′) è data da:
dove v è la velocità di assestamento della particella nel caso non ostacolato, e φ è la frazione di volume delle particelle. Il sangue è tipicamente diluito in brodo per emocolture ad una diluizione di 1:4 (22). Poiché l’ematocrito (frazione di volume dei globuli rossi nel sangue) è tipicamente intorno a 0,4-0,45 (23), la frazione di volume risultante dei globuli rossi nel nostro campione è circa 0,1. Se si tiene conto di questo utilizzando l’equazione 12, allora le velocità di sedimentazione previste per i globuli rossi nei mezzi 1 e 2 sono rispettivamente 307 micron/secondo e 62 micron/secondo. Inoltre, quando le emocolture diventano positive, contengono ∼108 CFU (unità formanti colonie) (cellule) di batteri per mL di sospensione (24). Tuttavia, a causa delle loro piccole dimensioni (raggio ∼1 micron), la loro frazione di volume rimane inferiore a 0,001, e l’effetto “decantazione ostacolata” può essere trascurato.
Dato un volume di campione da cui si desidera isolare il tipo di cella (s) di interesse, il diagramma di flusso fornito nei materiali supplementari (Figura 1 supplementare) può essere utilizzato per guidare la scelta del tampone di sedimentazione, prevedere le velocità di sedimentazione delle cellule di interesse nel buffer detto, determinare il volume appropriato (lunghezza della colonna nel tubo di centrifugazione disponibile) da utilizzare, e infine calcolare la durata ottimale di centrifugazione (finestra operativa) utilizzando la centrifuga (s) disponibile. Per il nostro sistema (5ml di brodo di emocoltura “positivo” caricato in provette da centrifuga da 15ml), il processo è riassunto nella tabella 1.
Convalida sperimentale
Abbiamo preparato un “brodo sintetico per emocolture positive” disperdendo in 8ml di terreno BACTEC Ped-Plus (Becton Dickinson, Sparks, MD), 2ml di sangue fresco (prelevato da un volontario) e 0.1ml di una sospensione contenente ∼104 CFU (cellule) per mL di E. coli K-12 e incubando la miscela su un mixer a 37°C per una notte (12-14 ore) per ottenere una sospensione contenente ∼109 RBCs/mL e 108 CFU/mL di batteri. 1,5 mL del brodo è stato prelevato in una provetta da microcentrifuga (Eppendorf, New York, USA) e le cellule sono state “pellettate” per centrifugazione. Il surnatante è stato ritirato e la massa di 1 ml è stata misurata con una bilancia (OHaus® GA-110) per stimare la densità del liquido nel brodo.
Inoltre, 5 mL di brodo di emocoltura positivo sono stati caricati su 5 mL di Histopaque-1083 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USA). Più tubi di questo tipo sono stati caricati in una centrifuga da banco Eppendorf-5804 e centrifugati per diversi periodi di tempo (1 min, 3 min, 6 min, 10 min, 15 min, 30 min, 50 min, 70 min e 90 min). Alla fine del processo di centrifugazione, la provetta è stata rimossa delicatamente, lo strato superiore (brodo di emocoltura) è stato scartato, mentre lo strato istopaco è stato raccolto senza disturbare il sedimento sul fondo (se presente). La concentrazione di batteri nel fluido raccolto è stata valutata con metodi standard che prevedono la diluizione in serie, la piastratura su Tryptic Soy Agar, l’incubazione e il conteggio delle colonie (25). Le concentrazioni di RBC sono state ottenute esaminando un’aliquota del campione in un emocitometro al microscopio (26).
Risultati e discussione
I risultati sono riassunti nella figura 3. Le linee rappresentano il numero teorico di cellule ematiche o batteri che ci si aspetta siano presenti nello strato istopaco (meno il sedimento sul fondo) in base alle nostre previsioni teoriche. I simboli solidi rappresentano la media di almeno tre letture di numeri osservati di RBC (quadrati), e E. coli (diamanti). Le barre di errore sono la deviazione standard.
Le linee rappresentano stime basate sui nostri modelli matematici.
Come si vede nella Figura 3, il comportamento osservato corrisponde qualitativamente alle nostre previsioni; per entrambe le particelle dense (RBC e batteri), le concentrazioni nell’Histopaque inizialmente aumentano con il tempo poi rimangono costanti per una certa durata e infine diminuiscono. Tuttavia, è stato riscontrato che per gli RBC, l’intero processo (aumento, stato stazionario e caduta) avviene leggermente più lentamente di quanto previsto. L’effetto di questa velocità di sedimentazione leggermente inferiore, fortunatamente, non influisce sulla nostra finestra operativa poiché l’inizio della finestra è governato dal tempo necessario a tutti i batteri per entrare nel tampone denso. Nel momento in cui ciò avviene, la concentrazione di RBC nel tampone denso è trascurabile. In altre parole, la finestra operativa prevista dai nostri modelli (da ∼20 min a ∼75 min) si dimostra valida.
I batteri più comuni sono anche abbastanza piccoli (∼1 micron di lunghezza caratteristica) e le loro densità sono simili. (ad esempio, 1,1 g/mL per Pseudomonas (27); 1,13 g/mL per Streptococcus (28), e 1,135 g/mL per Bacillus (29)). È quindi probabile che abbiano velocità di sedimentazione paragonabili a E. coli sia in brodo di emocoltura che in Histopaque-1083, e di conseguenza, anche la finestra operativa dovrebbe essere simile. Sebbene la nostra finestra operativa (da ∼20 min a ∼75 min) sia applicabile solo per il nostro hardware e i nostri parametri sperimentali, la nostra analisi teorica fornisce una base per prevedere altre finestre operative, non solo allo scopo di isolare i batteri da brodi di emocoltura positivi utilizzando diversi hardware, ma anche per isolare altre cellule bersaglio da diverse matrici utilizzando tamponi densi. Questo metodo può anche essere utilizzato in modo sequenziale per isolare un bersaglio da una miscela contenente sia specie a sedimentazione più rapida che a sedimentazione più lenta. In tali casi, si dovrebbe usare il nostro metodo per eliminare prima tutte le specie in movimento più veloce, e successivamente, usarlo per raccogliere il bersaglio più veloce specie sedimentazione nella miscela rimanente.
Riconoscimenti
Vorremmo ringraziare il Prof. Azlin Mustapha per fornire i batteri E.coli K-12 utilizzati. J.T. e B.D.L. sono stati supportati da una borsa di studio iniziale rilasciata dall’Università del Missouri a S.S. Inoltre, B.D.L. è stato anche supportato dalla Cheongbung Scholarship Foundation, Corea del Sud.
Interessi concorrenti
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Dati supplementari
Per visualizzare i dati supplementari che accompagnano questo articolo si prega di visitare il sito web della rivista: www.future-science.com/doi/suppl/10.2144/0000113853